Epigenética en la diferenciación de células madre

Las células madre embrionarias son capaces de autorrenovarse y diferenciarse hacia el destino deseado según su posición en el cuerpo. La homeostasis de las células madre se mantiene mediante mecanismos epigenéticos altamente dinámicos que regulan la estructura de la cromatina , así como programas específicos de transcripción génica . ^{[ 1 ]} La epigenética se ha utilizado para referirse a los cambios en la expresión génica , que son heredables a través de modificaciones que no afectan la secuencia de ADN . ^{[ 2 ]}

El epigenoma de los mamíferos experimenta una remodelación global durante el desarrollo temprano de las células madre, lo que requiere que las células se comprometan con el linaje deseado. Existen múltiples evidencias que sugieren que el mantenimiento del compromiso de linaje de las células madre está controlado por mecanismos epigenéticos como la metilación del ADN , las modificaciones de las histonas y la regulación de la remodelación de la estructura de la cromatina dependiente de ATP . ^{[ 1 ] [ 3 ]} Según la hipótesis del código de histonas , distintas modificaciones covalentes de las histonas pueden conducir a estructuras de cromatina funcionalmente distintas que influyen en el destino celular.

Esta regulación de la cromatina mediante modificaciones epigenéticas es un mecanismo molecular que determina si la célula continúa diferenciándose hacia el destino deseado. Un estudio de investigación realizado por Lee et al. examinó los efectos de las modificaciones epigenéticas en la estructura de la cromatina y la modulación de estos marcadores epigenéticos durante la diferenciación de células madre mediante la diferenciación in vitro de células madre embrionarias murinas (ES). ^{[ 4 ]}

Las células madre embrionarias presentan alteraciones drásticas y complejas tanto en las estructuras de cromatina globales como en las específicas de cada sitio . Lee et al. realizaron un experimento para determinar la importancia de la desacetilación y la acetilación para la diferenciación de células madre, analizando los niveles globales de acetilación y metilación en ciertas modificaciones específicas de los sitios de histonas H3K9 y H3K4 . La expresión génica en estas histonas, regulada por modificaciones epigenéticas, es fundamental para restringir la célula madre embrionaria a los linajes celulares deseados y desarrollar la memoria celular .

En las células de mamíferos, el mantenimiento de la metilación de la citosina está catalizado por las ADN metiltransferasas y cualquier alteración de estas metiltransferasas causará un fenotipo letal en el embrión. La metilación de la citosina se examina en H3K9 , que está asociada con la heterocromatina inactiva y ocurre principalmente en los dinucleótidos CpG , mientras que la acetilación global se examina en H3K4 , que está asociada con la eucromatina activa . El genoma cigótico de los mamíferos experimenta una desmetilación global activa y pasiva de la citosina después de la fertilización que alcanza un punto mínimo del 20% de metilación de CpG en la etapa de blastocisto , al que luego le sigue una ola de metilación que reprograma la estructura de la cromatina para restaurar los niveles globales de metilación de CpG al 60%. ^{[ 4 ]} Las células madre embrionarias que contienen niveles reducidos o elevados de metilación son viables pero incapaces de diferenciarse y, por lo tanto, requieren una regulación crítica de la metilación de la citosina para el desarrollo de los mamíferos.

Se analizaron las modificaciones de las histonas en la cromatina a intervalos de tiempo variables (durante un período de 6 días) tras el inicio de la diferenciación de células madre embrionarias in vitro . La eliminación del factor inhibidor de la leucemia (LIF) desencadena la diferenciación. Los datos representativos de las modificaciones de las histonas en los sitios específicos tras la eliminación del LIF, evaluados mediante Western blot , confirman una fuerte desacetilación en las posiciones H3K4 y H3K9 de la histona H3 al cabo de un día, seguida de un ligero aumento de la acetilación al segundo día.

La metilación de la histona H3K4 también disminuyó un día después de la eliminación de LIF, pero se recuperó entre los días 2 y 4 de diferenciación, para finalmente disminuir en el quinto día. Estos resultados indican una disminución en el nivel de marcas epigenéticas de eucromatina activa al inicio de la diferenciación de células madre embrionarias, seguida inmediatamente por la reprogramación del epigenoma.

Las modificaciones de histonas en la posición H3K9 muestran una disminución en la di- y trimetilación de las células madre embrionarias no diferenciadas y un aumento gradual de la metilación durante el transcurso de seis días de la diferenciación in vitro, lo que indica que existe un aumento global de los niveles de heterocromatina inactiva en esta marca de histona.

A medida que la célula madre embrionaria se diferencia, los marcadores de eucromatina activa (acetilación de histonas y metilación de H3K4 ) disminuyen tras la eliminación de LIF, lo que demuestra que la célula se está diferenciando cada vez más. El ligero repunte de cada uno de estos marcadores permite que continúe la diferenciación, al brindar otra oportunidad para que disminuyan nuevamente, acercando así la célula a su estado maduro. Dado que también se observa un aumento durante los seis días en H3K9me , un marcador de heterocromatina activa, se concluye que, una vez que se produce la diferenciación, la formación de heterocromatina ocurre a medida que la célula se diferencia hacia su destino deseado, lo que la inactiva para prevenir una mayor diferenciación.

En los mamíferos, la metilación del ADN desempeña un papel en la regulación de un componente clave de la multipotencia : la capacidad de autorrenovarse rápidamente. Khavari et al. analizaron los mecanismos fundamentales de la metilación del ADN y su interacción con varias vías que regulan la diferenciación. ^{[ 5 ]} Nuevos enfoques que estudian el estado genómico de la metilación del ADN en diversos estados de diferenciación han demostrado que la metilación en los sitios CpG asociados con supuestos potenciadores es importante en este proceso. La metilación del ADN puede modular las afinidades de unión de los factores de transcripción mediante el reclutamiento de represores como MeCP2 , que muestran especificidad de unión para secuencias que contienen dinucleótidos CpG metilados. La metilación del ADN está controlada por ciertas metiltransferasas , DMNT , que realizan diferentes funciones dependiendo de cada una. Tanto DNMT3A como DNMT3B se han relacionado con la formación del patrón de metilación del ADN durante el desarrollo temprano de la célula madre, mientras que DNMT1 es necesaria para metilar una cadena de ADN recién sintetizada después de la replicación celular, con el fin de mantener el estado de regulación epigenética. Numerosas proteínas pueden interactuar físicamente con las propias DNMT , lo que ayuda a dirigir DNMT1 hacia el ADN hemimetilado.

Varios estudios recientes señalan el papel central de la metilación del ADN en la regulación de los ciclos celulares y las vías de reparación del ADN para mantener el estado indiferenciado . En células madre embrionarias, la depleción de DNMT1 en el compartimento de células progenitoras indiferenciadas provocó la detención del ciclo celular, la diferenciación prematura y un fallo en la autorrenovación tisular. La pérdida de DNMT1 se produjo por efectos profundos asociados a la activación de genes de diferenciación y la pérdida de genes que promueven la progresión del ciclo celular, lo que indica que DNMT1 y otras DNMT no suprimen continuamente la diferenciación y, por lo tanto, mantienen el estado pluripotente .

Estos estudios ponen de manifiesto la importancia de la interacción de las DNMT para mantener los estados de células madre, lo que permite una mayor diferenciación y la formación de heterocromatina.

Okamoto et al. documentaron previamente que el nivel de expresión del gen Oct4 disminuye con la diferenciación de células madre embrionarias. ^{[ 6 ]} Lee et al. realizaron un análisis ChIP de la región promotora de Oct4, asociada a células indiferenciadas, para examinar las modificaciones epigenéticas de los genes regulados que se desarrollan durante la diferenciación de células madre embrionarias. Esta región promotora disminuyó en los sitios de metilación de H3K4 y acetilación de H3K9 y aumentó en el sitio de metilación de H3K9 durante la diferenciación. El análisis de un motivo CpG del promotor del gen Oct4 reveló un aumento progresivo de la metilación del ADN y se metiló completamente en el día 10 de diferenciación, como se informó previamente en Gidekel y Bergman. ^{[ 7 ]}

Estos resultados indican que se produjo un cambio de la eucromatina activa a la heterocromatina inactiva debido a la disminución de la acetilación de H3K4 y al aumento de H3K9me. Esto significa que la célula se está diferenciando en el gen Oct4, lo cual coincide con el silenciamiento de su expresión.

Otro gen específico del sitio probado para la modificación de histonas fue un gen Brachyury , un marcador de diferenciación del mesodermo y que se expresa solo ligeramente en células madre embrionarias no diferenciadas. "Brachyury" se indujo en el día cinco de diferenciación y se silenció completamente en el día 10, que corresponde al último día de diferenciación. ^{[ 8 ]} El análisis ChIP del promotor del gen "Brachyury" reveló un aumento de la expresión en mono- y dimetilación de H3K4 en los días 0 y 5 de diferenciación de células madre embrionarias con una pérdida de la expresión génica en el día 10. La trimetilación de H3K4 coincide con el momento de mayor expresión del gen Brachyury ya que solo tuvo expresión génica en el día 5. Las metilaciones de H3K4 en todas las formas están ausentes en el día 10 de diferenciación, lo que se correlaciona con el silenciamiento de la expresión del gen Brachyury. La monometilación de ambas histonas produjo expresión en el día 0, lo que indica un marcador que no es útil para la estructura de la cromatina. La acetilación de H3K9 no se correlaciona con la expresión del gen Brachyury , ya que se redujo durante la inducción de la diferenciación. Al examinar la expresión de la metilación del ADN, no se observó la formación de fragmentos intermedios en el análisis Southern, lo que sugiere que los motivos CpG situados aguas arriba de la región promotora no se metilan en ausencia de metilación de citosina en este sitio.

Estos estudios demuestran que tanto la dimetilación como la trimetilación de H3K9 se correlacionan con la metilación del ADN y la expresión génica, mientras que la trimetilación de H3K4 se asocia con la etapa de mayor expresión génica del gen Brachyury . Un informe previo de Santos-Rosa concuerda con estos datos, mostrando que los genes activos se asocian con la trimetilación de H3K4 en levaduras. ^{[ 9 ]}

Estos datos indicaron los mismos resultados que para el gen Oct4 , en el sentido de que la heterocromatina se está formando a medida que se produce la diferenciación, coincidiendo de nuevo con el silencio de la expresión del gen Brachyury .

En un estudio realizado por Mierlo et al., se obtuvieron datos que sugieren que patrones únicos de H3K27me3 y complejos represores de policomb PCR2 protegen a las ESC de abandonar el estado basal o entrar en un estado de preparación. ^{[ 10 ]} Partieron de la observación de que las ESC en estado basal se mantienen mediante LIF o 2i, y comenzaron a investigar cómo era el epigenoma en estado basal. Mediante el perfilado ChIP-seq, pudieron determinar que los niveles basales de H3K27me3 eran más altos en las ESC 2i en comparación con los del suero (preparadas). Esta conclusión se vio respaldada por el hallazgo en el mismo artículo de que las ESC 2i adquirieron cualidades similares a las de las células preparadas tras la eliminación de un complejo PRC2 funcional, lo que hizo que H3K27me3 fuera inútil. ^{[ 10 ]}

El factor inhibidor de la leucemia (LIF) se eliminó de todas las líneas celulares . El LIF inhibe la diferenciación celular, y su eliminación permite que las líneas celulares se diferencien. Las líneas celulares se trataron con tricostatina A (TSA), un inhibidor de la histona deacetilasa, durante 6 días. Un grupo de líneas celulares se trató con 10 nM de TSA. El análisis Western blot mostró la ausencia de desacetilación inicial en el día 1, lo cual se observó en el control para la diferenciación de células madre embrionarias. La ausencia de actividad de la histona deacetilasa permitió la acetilación de H3K9 y la histona H4 . Las células madre embrionarias también se analizaron morfológicamente para observar la formación de cuerpos embrionarios como una de las medidas de diferenciación celular. Las células tratadas con 10 nM de TSA no lograron formar cuerpos embrionarios en el día 6, como se observó en la línea celular de control. Esto implica que las células ES tratadas con TSA carecían de desacetilación en el día 1 y no se diferenciaron después de la eliminación del LIF. El segundo grupo, '-TSA Día 4', fue tratado con TSA durante 3 días. Tan pronto como se interrumpió el tratamiento con TSA, el día 4 se observó la desacetilación y la acetilación se recuperó el día 5. El examen morfológico mostró la formación de cuerpos embrionarios el día 6. Además, la formación de cuerpos embrionarios fue más rápida que en la línea celular de control. Esto sugiere que las líneas '-TSA Día 4' respondieron a la eliminación de LIF, pero no pudieron adquirir ningún fenotipo de diferenciación. Pudieron adquirir el fenotipo de diferenciación después de la interrupción del tratamiento con TSA y a un ritmo rápido. El examen morfológico del tercer grupo, '5 nM TSA', mostró un efecto intermedio entre el grupo de control y el grupo de 10 nM-TSA. La dosis más baja de TSA permitió la formación de algunos cuerpos embrionarios. Este experimento muestra que el TSA inhibe la histona desacetilasa y que la actividad de la histona desacetilasa es necesaria para la diferenciación de las células madre embrionarias. Sin la desacetilación inicial en el día 1, las células ES no pueden completar el proceso de diferenciación.

Las fosfatasas alcalinas presentes en los humanos son glicoproteínas unidas a la membrana que catalizan la hidrólisis de ésteres monofosfato. McKenna et al. (1979) descubrieron que existen al menos tres variedades de fosfatasas alcalinas: renal, hepática y ósea, codificadas por el mismo gen estructural, pero con fragmentos de carbohidratos distintos. Por lo tanto, las diferentes variedades de fosfatasas alcalinas expresan un conjunto único de enzimas en los procesos enzimáticos de glicosilación postraduccional de proteínas. ^{[ 11 ]}

En las células madre normales, la actividad de la fosfatasa alcalina disminuye durante la diferenciación. La tricostatina A hace que las células mantengan la actividad de la fosfatasa alcalina. La tricostatina A puede causar una inhibición reversible de la histona deacetilasa de mamíferos, lo que conduce a la inhibición del crecimiento celular. Se observó un aumento significativo en la extinción de la fosfatasa alcalina cuando se retiró la tricostatina A después de tres días. La actividad de la fosfatasa alcalina se correlaciona con los cambios morfológicos. La desacetilación inicial de la histona es necesaria para la diferenciación de las células madre embrionarias. ^{[ 12 ]}

Dovery et al. (2010) utilizaron ratones knockout de HDAC para demostrar si HDAC1 o HDAC2 eran importantes para la diferenciación de células madre embrionarias. El examen de la acetilación global de histonas en ausencia de HDAC1 mostró un aumento en la acetilación. Los niveles de acetilación global de histonas no se modificaron por la pérdida de HDAC2. Para analizar el proceso del ratón knockout de HDAC en detalle, se utilizaron células madre embrionarias de estos ratones para generar cuerpos embrionarios. Se demostró que justo antes o durante la gastrulación , las células madre embrionarias que carecían de HDAC1 adquirían defectos de desarrollo visibles. El cultivo continuo de células madre embrionarias knockout de HDAC1 mostró que los cuerpos embrionarios formados se volvían irregulares y de tamaño reducido en lugar de uniformemente esféricos como en los ratones normales. La proliferación de células madre embrionarias no se vio afectada por la pérdida de HDAC1 o HDAC2, pero la diferenciación de las células madre embrionarias sí se vio afectada por la falta de HDAC1. Esto demuestra que HDAC1 es necesario para la determinación del destino celular durante la diferenciación. ^{[ 13 ]}

En un estudio realizado por Chronis et al. (2017), se descubrió que durante la reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes , OSK (tres de los cuatro factores de Yamanaka: Oct4, Sox2 , KLF4 , c-Myc ) trabaja junto con otros factores de transcripción para modificar el panorama de los potenciadores, lo que conlleva la pérdida de diferenciación y la ganancia de pluripotencia. Lograron determinar esto mapeando los estados de cromatina de unión de OSKM en las etapas de reprogramación y realizando experimentos de pérdida y ganancia de función. También concluyeron que OSK silencia ME ( potenciadores MEF ) parcialmente a través de Hdac1, lo que sugiere que Hdac1 desempeña un papel en el proceso de reprogramación de células somáticas. ^{[ 14 ]}

Se sabe que la epigenética es importante en la regulación de la expresión génica de la diferenciación. Por lo tanto, los estudios realizados sobre moléculas pequeñas o fármacos que inhiben los mecanismos epigenéticos durante la diferenciación pueden tener un gran potencial para aplicaciones clínicas como la regeneración ósea a partir de células madre mesenquimales . ^{[ 15 ]} Un ejemplo de dicha aplicación es el uso de decitabina (un análogo de la desoxicitidina ) para agotar la ADN metiltransferasa 1 (DNMT1) en el contexto de los melanomas . ^{[ 16 ]} Alcazar et al. hicieron esto con la intención de causar cambios en la expresión génica (como resultado del agotamiento de DNMT1) que llevarían a la diferenciación de los melanocitos , lo que llevaría a la inhibición del crecimiento tumoral. Las moléculas pequeñas como estas (epidrugs) – si bien albergan un gran potencial para uso terapéutico – también están asociadas con riesgos. Volviendo al DNMTi (decitabina), existen efectos secundarios conocidos como la anemia que puede ocurrir, además de otros efectos inesperados fuera de objetivo. ^{[ 15 ]} Esto subraya la importancia de mejorar la especificidad del objetivo del fármaco epidérmico y de idear métodos nuevos y mejorados de administración de fármacos. ^{[ 15 ]}

C. Waddington acuñó la metáfora del “ paisaje epigenético ”, en la que una canica rueda por un paisaje, su curso determinado por la topografía del terreno, trabajando finalmente hacia un punto más bajo. En diferentes puntos, estos caminos se ramifican y la canica sigue uno de ellos. En esta metáfora, la canica es una célula durante el desarrollo, y esta metáfora puede extenderse a la dinámica de la regulación génica que subyace a la diferenciación celular (epigenética). ^{[ 17 ]} Wang et al. (2011) desarrollaron un marco teórico/matemático para esto, que es significativo porque es uno de los primeros intentos de vincular la idea del paisaje de Waddington con las redes de regulación génica de una manera basada en datos. Esto, en sus propias palabras, proporciona un “marco para estudiar la naturaleza global de la decisión de destino binario y el compromiso de una célula multipotente en uno de dos destinos celulares”, lo que puede ser una herramienta extremadamente valiosa para la reprogramación celular o simplemente para aprender más sobre lo que podría impulsar la diferenciación.

Cualquier alteración de la regulación epigenética estable de la expresión génica mediada por la metilación del ADN se asocia con una serie de trastornos humanos, incluido el cáncer, así como enfermedades congénitas como el pseudohipoparatiroidismo tipo IA , el síndrome de Beckwith-Wiedemann , el síndrome de Prader-Willi y el síndrome de Angelman , cada uno de los cuales es causado por una impronta basada en la metilación alterada en loci específicos.

Las perturbaciones de los patrones de metilación de citosina, tanto globales como específicos de genes, se observan comúnmente en el cáncer, mientras que la desacetilación de histonas es una característica importante de la reprogramación nuclear en los ovocitos durante la meiosis . ^{[ 18 ]}

Estudios recientes han revelado que existe una variedad de vías diferentes que cooperan entre sí para conferir una regulación epigenética adecuada mediante la metilación del ADN. Se necesitarán estudios futuros para aclarar aún más las vías de mecanismos específicos, como las proteínas de unión al ADN , la reparación del ADN y los ARN no codificantes, que regulan la metilación del ADN para suprimir la diferenciación y mantener la autorrenovación en las células madre somáticas de la epidermis y otros tejidos. Abordar estas cuestiones ayudará a ampliar la comprensión de estos hallazgos recientes sobre el papel central de los reguladores epigenéticos de la metilación del ADN en el control de la diferenciación de las células madre embrionarias. ^{[ 5 ]}