cuerpo embrioide

Los cuerpos embrioides ( CE ) son agregados tridimensionales formados por células madre pluripotentes . Estos incluyen células madre embrionarias (CME) y células madre pluripotentes inducidas (iPSC).

Los cuerpos embrionarios (CE) son diferenciaciones de células madre embrionarias humanas que comprenden las tres capas germinales embrionarias. Imitan las características observadas en embriones en etapas tempranas. Se utilizan frecuentemente como sistema modelo para investigar diversos aspectos de la biología del desarrollo . También pueden contribuir a la investigación centrada en la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa.

Los tipos de células pluripotentes que componen los cuerpos embrionarios incluyen células madre embrionarias (CME) derivadas de la etapa de blastocisto de embriones de ratón (CMEm), ^{[ 1 ] [ 2 ]} primates, ^{[ 3 ]} y humanos (CMEh) ^{[ 4 ]} . Además, los EB pueden formarse a partir de células madre embrionarias derivadas mediante técnicas alternativas, incluyendo la transferencia nuclear de células somáticas ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]} o la reprogramación de células somáticas para producir células madre pluripotentes inducidas (iPSC). ^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]} De manera similar a las CME cultivadas en formatos de monocapa, las CME dentro de los cuerpos embrionarios experimentan diferenciación y especificación celular a lo largo de los tres linajes germinales : endodermo, ectodermo y mesodermo, que comprenden todos los tipos de células somáticas . ^{[ 12 ] [ 13 ]}

A diferencia de los cultivos monocapa, las estructuras esferoidales que se forman cuando las ESC se agregan permiten el cultivo no adherente de EB en suspensión, lo que hace que los cultivos de EB sean inherentemente escalables, lo cual es útil para enfoques de bioprocesamiento, mediante los cuales se pueden producir grandes rendimientos de células para posibles aplicaciones clínicas. ^{[ 14 ]} Además, aunque los EB exhiben en gran medida patrones heterogéneos de tipos celulares diferenciados, las ESC son capaces de responder a señales similares que dirigen el desarrollo embrionario . ^{[ 15 ]} Por lo tanto, la estructura tridimensional, incluido el establecimiento de adhesiones celulares complejas y señalización paracrina dentro del microambiente del EB, ^{[ 16 ]} permite la diferenciación y la morfogénesis que produce microtejidos que son similares a las estructuras de tejido nativo. Dichos microtejidos son prometedores para reparar directa ^{[ 15 ]} o indirectamente ^{[ 17 ] [ 18 ]} tejido dañado o enfermo en aplicaciones de medicina regenerativa, así como para pruebas in vitro en la industria farmacéutica y como modelo de desarrollo embrionario.

Los EB se forman por la unión homofílica de la molécula de adhesión dependiente de Ca2+ E-cadherina , que se expresa en gran medida en las ESC no diferenciadas. ^{[ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]} Cuando se cultivan como células individuales en ausencia de factores antidiferenciación, las ESC se agregan espontáneamente para formar EB. ^{[ 19 ] [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ]} Esta formación espontánea se logra a menudo en cultivos en suspensión masiva donde la placa se recubre con materiales no adhesivos, como agar o polímeros hidrofílicos, para promover la adhesión preferencial entre células individuales, en lugar de al sustrato de cultivo. Como las hESC sufren apoptosis cuando se cultivan como células individuales, la formación de EB a menudo requiere el uso de inhibidores de la vía de la cinasa asociada a rho (ROCK), incluidas las pequeñas moléculas Y-27632 ^{[ 25 ]} y 2,4 disustituido tiazol (Thiazovivin/Tzv). ^{[ 26 ]} Como alternativa, para evitar la disociación en células individuales, los cuerpos embrioides (EB) pueden formarse a partir de células madre embrionarias humanas (hESC) mediante la separación manual de colonias adherentes (o regiones de colonias) y su posterior cultivo en suspensión. La formación de EB en suspensión permite la formación de grandes cantidades de EB, pero ofrece poco control sobre el tamaño de los agregados resultantes, lo que a menudo da lugar a EB grandes y de forma irregular. Como alternativa, las fuerzas hidrodinámicas ejercidas en las plataformas de cultivo mixto aumentan la homogeneidad del tamaño de los EB cuando las células madre embrionarias se inoculan en suspensiones a granel. ^{[ 27 ]}

La formación de EB también puede controlarse con mayor precisión mediante la inoculación de densidades celulares conocidas en gotas individuales (10-20 μL) suspendidas de la tapa de una placa de Petri , conocidas como gotas colgantes. ^{[ 21 ]} Si bien este método permite controlar el tamaño de los EB al alterar el número de células por gota, la formación de gotas colgantes requiere mucho trabajo y no es fácilmente adaptable a cultivos a gran escala. Además, el medio no se puede intercambiar fácilmente dentro del formato tradicional de gota colgante, lo que requiere la transferencia de las gotas colgantes a cultivos en suspensión a granel después de 2-3 días de formación, donde los EB individuales tienden a aglomerarse. Recientemente, se han desarrollado nuevas tecnologías para permitir el intercambio de medios dentro de un formato de gota colgante modificado. ^{[ 28 ]} Además, también se han desarrollado tecnologías para separar físicamente las células mediante la agregación forzada de ESC dentro de pocillos individuales o confinadas en sustratos adhesivos, ^{[ 29 ] [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ]} lo que permite un mayor rendimiento y una formación controlada de EB. En última instancia, los métodos utilizados para la formación de EB pueden afectar la heterogeneidad de las poblaciones de EB, en términos de cinética de agregación, tamaño y rendimiento de EB, así como trayectorias de diferenciación. ^{[ 31 ] [ 33 ] [ 34 ]}

Dentro del contexto de los protocolos de diferenciación de ESC , la formación de EB se utiliza a menudo como método para iniciar la diferenciación espontánea hacia los tres linajes germinales . La diferenciación de EB comienza con la especificación de las células externas hacia el fenotipo del endodermo primitivo. ^{[ 35 ] [ 36 ]} Las células en el exterior luego depositan matriz extracelular (ECM), que contiene colágeno IV y laminina , ^{[ 37 ] [ 38 ]} similar a la composición y estructura de la membrana basal . En respuesta al depósito de ECM, los EB a menudo forman una cavidad quística, donde las células en contacto con la membrana basal permanecen viables y las del interior sufren apoptosis, lo que resulta en una cavidad llena de líquido rodeada de células. ^{[ 39 ] [ 40 ] [ 41 ]} La diferenciación posterior procede a formar derivados de los tres linajes germinales. En ausencia de suplementos, la diferenciación "por defecto" de las ESC es en gran medida hacia el ectodermo y los linajes neurales posteriores . ^{[ 42 ]} Sin embargo, se han desarrollado composiciones de medios alternativos, incluido el uso de suero fetal bovino , así como aditivos de factores de crecimiento definidos, para promover la diferenciación hacia los linajes mesodérmico y endodérmico . ^{[ 43 ] [ 44 ] [ 45 ]}

Como resultado de la estructura tridimensional de los EB, se produce una morfogénesis compleja durante la diferenciación de los EB, incluyendo la aparición de poblaciones celulares tanto epiteliales como mesenquimales, así como la aparición de marcadores asociados con la transición epitelio-mesenquimal (EMT). ^{[ 46 ] [ 47 ]} Además, los efectos inductivos resultantes de la señalización entre poblaciones celulares en los EB dan lugar a cambios definidos espacial y temporalmente, que promueven una morfogénesis compleja . ^{[ 48 ]} A menudo se exhiben estructuras similares a tejidos dentro de los EB, incluyendo la aparición de islas sanguíneas que recuerdan a las estructuras tempranas de vasos sanguíneos en el embrión en desarrollo, así como el patrón de extensiones de neuritas (indicativo de organización neuronal) y actividad contráctil espontánea (indicativo de diferenciación de cardiomiocitos ) cuando los EB se cultivan en sustratos adhesivos como la gelatina . ^{[ 13 ]} Más recientemente, se crearon in vitro estructuras complejas, incluyendo estructuras similares a copas ópticas, como resultado de la diferenciación de los EB. ^{[ 49 ]}

Gran parte de la investigación central sobre la diferenciación y morfogénesis de células madre embrionarias se deriva de estudios en biología del desarrollo y embriogénesis de mamíferos. ^{[ 15 ]} Por ejemplo, inmediatamente después de la etapa de blastocisto del desarrollo (de la cual se derivan las ESC), el embrión sufre diferenciación, por la cual la especificación celular de la masa celular interna da como resultado la formación del hipoblasto y el epiblasto . ^{[ 50 ]} Más adelante en el desarrollo posterior a la implantación, se forma el eje anteroposterior y el embrión desarrolla una estructura transitoria conocida como la línea primitiva. ^{[ 51 ]} Gran parte del patrón espacial que ocurre durante la formación y migración de la línea primitiva resulta de la secreción de agonistas y antagonistas por varias poblaciones celulares, incluidos los factores de crecimiento de las familias Wnt y del factor de crecimiento transformante β (TGFβ) (Lefty 1, Nodal), así como represores de las mismas moléculas (Dkk-1, Sfrp1, Sfrp5). ^{[ 52 ] [ 53 ] [ 54 ]} Debido a las similitudes entre la embriogénesis y la diferenciación de las ESC, muchos de los mismos factores de crecimiento son fundamentales para los enfoques de diferenciación dirigida.

Además, los avances en el cultivo de EB dieron como resultado el desarrollo de organoides embrionarios (gastruloides) que muestran notables paralelismos con el desarrollo embrionario ^{[ 46 ] [ 55 ] [ 56 ] [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ] [ 60 ]} tales como la ruptura de la simetría, la expresión localizada de brachyury , la formación de los ejes embrionarios (anteroposterior, dorsoventral e izquierda-derecha) y movimientos similares a la gastrulación. ^{[ 46 ] [ 55 ] [ 56 ] [ 57 ]}

A diferencia de la diferenciación de ESC en cultivos monocapa, donde la adición de morfógenos solubles y el microambiente extracelular se pueden controlar de manera precisa y homogénea, la estructura tridimensional de los EB plantea desafíos para la diferenciación dirigida. ^{[ 16 ] [ 61 ]} Por ejemplo, la población de endodermo visceral que forma el exterior de los EB, crea una "capa" externa que consiste en células similares a epiteliales estrechamente conectadas , así como una ECM densa . ^{[ 62 ] [ 63 ]} Debido a tales restricciones físicas, en combinación con el tamaño de los EB, se producen limitaciones de transporte dentro de los EB, creando gradientes de morfógenos, metabolitos y nutrientes. ^{[ 61 ]} Se ha estimado que el transporte de oxígeno es limitado en agregados celulares mayores de aproximadamente 300  μm de diámetro; ^{[ 64 ]} sin embargo, el desarrollo de tales gradientes también se ve afectado por el tamaño de la molécula y las tasas de captación celular. Por lo tanto, la administración de morfógenos a los EBs resulta en una mayor heterogeneidad y una menor eficiencia de las poblaciones celulares diferenciadas en comparación con los cultivos monocapa. Un método para abordar las limitaciones de transporte dentro de los EBs ha sido a través de la administración polimérica de morfógenos desde dentro de la estructura del EB. ^{[ 62 ] [ 65 ] [ 66 ]} Además, los EBs pueden cultivarse como microtejidos individuales y posteriormente ensamblarse en estructuras más grandes para aplicaciones de ingeniería de tejidos. ^{[ 67 ]} Si bien la complejidad resultante de las adhesiones y la señalización tridimensionales puede recapitular estructuras de tejido más nativas, ^{[ 68 ] [ 69 ]} también crea desafíos para comprender las contribuciones relativas de las señales mecánicas, químicas y físicas a los fenotipos celulares y la morfogénesis resultantes.

• organoide cerebral
• Gastruloide
• Células madre inducidas
• Pluripotencia