Microscopía dinámica diferencial

La microscopía dinámica diferencial ( DDM ) es una técnica óptica basada en imágenes que permite realizar experimentos similares a la dispersión de luz mediante un microscopio óptico convencional . Utiliza secuencias temporales de imágenes de microscopio para extraer información dinámica sobre fluctuaciones microscópicas en un rango de escalas de longitud y retardos de tiempo, análogo a lo que se obtiene en experimentos de dispersión dinámica de luz (DLS) . ^{[ 1 ] [ 2 ]} La DDM es adecuada para materiales blandos típicos como líquidos , geles , suspensiones de coloides y polímeros , cristales líquidos y se ha aplicado a varios sistemas biológicos, incluidas bacterias y células .

La técnica DDM fue introducida en 2008 por Cerbino y Trappe como una forma de investigar la dinámica de partículas coloidales resuelta en vector de onda utilizando un microscopio equipado con una cámara de alta velocidad , demostrando que se puede extraer información dinámica similar a la obtenida en DLS a partir de imágenes de lapso de tiempo tomadas en el espacio real. ^{[ 1 ]} Este artículo fundamental ha acumulado varias citas, estableciendo la capacidad única de DDM para combinar capacidades de imagen con análisis de vector de onda basado en dispersión. Poco después, Giavazzi et al. discutieron extensiones a otras modalidades de imagen, también basadas en fluorescencia, y aclararon las conexiones de DDM con métodos de dispersión basados ​​en imágenes relacionados (ver más abajo la sección Relación con otros métodos de dispersión basados ​​en imágenes ). ^{[ 2 ]}

Estudios posteriores aplicaron DDM para caracterizar la motilidad bacteriana y la dinámica de los microorganismos, mostrando cómo se puede obtener la velocidad de natación promedio de la población y otros parámetros de motilidad sin el seguimiento de partículas individuales. ^{[ 3 ] [ 4 ]}

DDM también se extendió a la microscopía de fluorescencia confocal para caracterizar sistemas fluorescentes concentrados, de dispersión múltiple y de accionamiento activo, ampliando el rango de muestras accesibles y modalidades de imagen. ^{[ 5 ]}

En 2014, Giavazzi y Cerbino proporcionaron una perspectiva más amplia sobre la microscopía digital de Fourier para la dinámica de la materia blanda, ubicando a DDM dentro de una familia más amplia de enfoques del espacio de Fourier que extraen información dinámica y de dispersión de secuencias de imágenes de microscopía. ^{[ 6 ]}

A medida que la técnica maduró, las revisiones exhaustivas consolidaron el campo. En 2017, Cerbino y Cicuta publicaron un artículo de perspectiva que resaltaba la capacidad de DDM para extraer actividad multiescala en fluidos complejos y sistemas biológicos, estableciéndola como una herramienta libre de sesgos para cuantificar la dinámica en diferentes escalas de longitud. ^{[ 7 ]} Posteriormente, en 2022, Cerbino, Giavazzi y Helgeson revisaron la aplicación de DDM específicamente para sistemas poliméricos, detallando su uso en la caracterización de soluciones, geles y compuestos poliméricos. ^{[ 8 ]}

Se han desarrollado introducciones pedagógicas y flujos de trabajo reproducibles para apoyar la adopción de DDM en diversas disciplinas. Un artículo reciente de Perspective revisó DDM como un enfoque emergente para medir coeficientes de difusión de macromoléculas y partículas utilizando videos de microscopía estándar, analizando las limitaciones prácticas y las oportunidades para mediciones de difusión con resolución espacial. ^{[ 9 ]} Germain et al. proporcionan una presentación de DDM en formato de tutorial, que incluye dos conjuntos de datos de ejemplo y scripts de análisis, en el American Journal of Physics . ^{[ 10 ]}

En 2025, se publicó un artículo tutorial completo titulado Guía del autoestopista para la microscopía dinámica diferencial , que proporciona una guía paso a paso sobre el diseño de experimentos, la adquisición y el análisis de datos, y enfatiza los flujos de trabajo reproducibles respaldados por software abierto y conjuntos de datos de ejemplo. ^{[ 11 ]}

DDM comienza con una película de microscopio, es decir, una secuencia temporal de imágenes.${\displaystyle I(\mathbf {r} ,t)}$Adquirida en un plano fijo de la muestra. La suposición clave es que las fluctuaciones de intensidad registradas están relacionadas con fluctuaciones de un campo físico de interés (a menudo la densidad numérica de partículas o estructuras marcadas con fluorescencia), posiblemente difuminadas por la función de dispersión puntual (PSF) del microscopio . ^{[ 1 ] [ 2 ]}

Para separar las escalas espaciales, cada imagen se analiza en el espacio de Fourier : las fluctuaciones se descomponen en modos etiquetados por un vector de onda.${\displaystyle \mathbf {q} }$, correspondiente a una escala de longitud característica${\displaystyle \sim 2\pi /q}$La dinámica se cuantifica comparando imágenes separadas por un retardo de tiempo.${\displaystyle \Delta t}$En la implementación más común, se calcula el espectro de potencia de Fourier de la diferencia entre dos imágenes separadas por${\displaystyle \Delta t}$y promedia esta cantidad en muchos pares para mejorar las estadísticas. Esto produce la función de estructura de la imagen.${\displaystyle D(q;\Delta t)}$, que aumenta desde un nivel de ruido/fondo en retrasos cortos hasta una meseta en retrasos largos a medida que las fluctuaciones se descorrelacionan. ^{[ 1 ] [ 2 ]}

En condiciones estándar,${\displaystyle D(q;\Delta t)}$puede estar relacionado con la función de dispersión intermedia normalizada${\displaystyle f(q;\Delta t)}$, es decir, la misma función de correlación dinámica que es fundamental para DLS. En consecuencia, al ajustar la${\displaystyle \Delta t}$-dependencia en cada${\displaystyle q}$Con modelos apropiados (difusión, advección/movimiento balístico, mezclas de procesos), DDM produce parámetros cuantitativos como coeficientes de difusión, velocidades características o tiempos de relajación. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 11 ]}

DDM complementa la dispersión dinámica de luz (DLS) tradicional y el seguimiento de partículas múltiples (MPT) al ofrecer ventajas y desventajas distintas que se adaptan a escenarios experimentales específicos. ^{[ 6 ] [ 9 ] [ 11 ]}

VENTAJAS SOBRE DLS

Rango de vector de onda: DDM accede a valores q más bajos que DLS convencional (típicamente 0,1–5 μm ⁻¹ ), lo que ofrece ventajas al caracterizar partículas más grandes.

Selección espacial: DDM permite la selección de regiones de interés (ROI), lo que posibilita la medición de muestras espacialmente heterogéneas y dinámicas localizadas que resultan difíciles o imposibles de estudiar en mediciones DLS de conjunto.

Flexibilidad óptica: DDM es compatible con varios mecanismos de contraste de microscopio (campo claro, contraste de fase, fluorescencia, confocal, luz polarizada, campo oscuro), mientras que DLS normalmente requiere iluminación láser.

Resistencia al polvo: DDM tolera las partículas de polvo estacionarias (por ejemplo, en las superficies de las células) y maneja bien las muestras con dispersión múltiple; DLS convencional es muy sensible al polvo y requiere la supresión de la luz parásita.

Volumen de muestra: DDM requiere solo microlitros de muestra; DLS normalmente requiere mililitros.

VENTAJAS SOBRE EL SEGUIMIENTO DE MÚLTIPLES PARTÍCULAS

Potencia estadística: DDM proporciona estadísticas de conjunto superiores al analizar simultáneamente todas las partículas en el campo de visión; MPT requiere una reconstrucción de trayectoria que requiere mucha intervención del usuario.

Sensibilidad subresolución: DDM no requiere que las partículas individuales estén resueltas ópticamente, lo que permite realizar mediciones en sistemas concentrados y ópticamente densos donde MPT tiene dificultades.

LIMITACIONES Y RESTRICCIONES PRÁCTICAS

Velocidad de medición: DDM requiere tiempos de adquisición prolongados (de minutos a horas) en comparación con DLS (segundos), por lo que DLS es la opción preferida para mediciones rápidas y rutinarias.

Tiempo de análisis: El análisis de datos requiere una gran capacidad de cálculo. Mientras que el procesamiento tradicional basado en CPU requería de minutos a horas por conjunto de datos, las implementaciones recientes aceleradas por GPU (por ejemplo, fastDDM) reducen este tiempo a segundos, lo que permite flujos de trabajo de alto rendimiento.

Madurez comercial: Los instrumentos y el software DLS son maduros y están ampliamente disponibles; DDM requiere configuraciones personalizadas o microscopios comerciales adaptados con software de análisis especializado.

Requisito de contraste óptico: El rendimiento de DDM depende fundamentalmente del contraste de la señal. Las muestras con baja dispersión pueden requerir una optimización cuidadosa de la iluminación o el marcaje fluorescente.

Compromisos en el rango dinámico: Los valores q más bajos accesibles (escalas de longitud más largas) corresponden a dinámicas muy lentas que requieren una adquisición prolongada; los valores q más altos requieren una alta magnificación y velocidades de fotogramas elevadas, lo que crea compromisos prácticos en la configuración del microscopio.

La proporcionalidad concentración-intensidad, que garantiza la validez del marco DDM, se cumple en dos clases principales de implementaciones de DDM:

DDM basado en dispersión : donde la intensidad de la imagen surge de la interferencia entre un haz transmitido fuerte y luz dispersa débilmente, como en campo claro , contraste de fase o imagen polarizada . DDM basado en fluorescencia : donde las imágenes resultan de la suma incoherente de emisiones de fluorescencia de partículas o estructuras marcadas, como en imagen de fluorescencia o confocal . En ambas clases, la convolución con la PSF en el espacio real se convierte en un producto simple en el espacio recíproco (Fourier), lo que permite analizar los modos de Fourier dados de la intensidad de la imagen para extraer la dinámica de los modos de concentración correspondientes. A diferencia del seguimiento de partículas , DDM no requiere resolver partículas individuales, lo que permite caracterizar la dinámica de características subresolución. La adquisición de imágenes en el espacio real también ofrece ventajas prácticas sobre los métodos tradicionales de dispersión de campo lejano, como la elección flexible de la modalidad de imagen y la robustez frente a artefactos de imagen estáticos.

El análisis DDM se basa en el algoritmo dinámico diferencial (DDA), desarrollado en el contexto de estudios de fluctuación óptica. ^{[ 12 ] [ 13 ]} En este enfoque, pares de imágenes separadas por un retardo${\displaystyle \Delta t}$Se restan para suprimir fondos estáticos y resaltar los cambios debidos al movimiento. Una transformada rápida de Fourier (FFT) bidimensional de las imágenes de diferencia produce una representación en el espacio de Fourier de la dinámica a través de las frecuencias espaciales. Promediando los espectros de potencia resultantes sobre muchos pares de imágenes con la misma${\displaystyle \Delta t}$(y, para muestras isotrópicas, sobre las direcciones del vector de onda) da como resultado la función de estructura de la imagen.${\displaystyle D(q;\Delta t)}$. El análisis teórico muestra que para las modalidades DDM comunes ^{[ 2 ]}

dónde${\displaystyle f(q;\Delta t)}$es la función de dispersión intermedia normalizada,${\displaystyle I(q)}$es la intensidad de dispersión estática,${\displaystyle B(q)}$es un término de fondo asociado con el ruido de detección, y${\displaystyle T(q)}$es una función de transferencia que depende de los detalles del microscopio y de las condiciones de imagen.

Para el movimiento browniano simple , se tiene${\displaystyle f(q;\Delta t)=\exp(-Dq^{2}\Delta t)}$, dónde${\displaystyle D}$es el coeficiente de difusión. Se utilizan modelos que incluyen movimiento dirigido (balístico), mezclas de poblaciones o distribuciones de velocidades para sistemas activos como las bacterias nadadoras. ^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]}

Una variante denominada multi-DDM analiza subregiones del fotograma de la imagen, de forma análoga a la variación del volumen de dispersión en la dispersión de luz tradicional. Esta variante puede revelar variaciones espaciales en la dinámica y resulta particularmente valiosa para el estudio de sistemas heterogéneos como redes biológicas y materiales con separación de fases, donde la dinámica local varía significativamente con la posición. ^{[ 14 ]}

El artículo tutorial de 2025, La guía del autoestopista para la microscopía dinámica diferencial, proporciona una guía práctica paso a paso para experimentos y análisis de DDM, y está asociado con software de código abierto y conjuntos de datos de acceso abierto destinados a la enseñanza y la reproducibilidad. ^{[ 11 ]}

Una implementación del análisis DDM utilizada en este tutorial se proporciona como el paquete de Python de código abierto fastDDM , con documentación y código fuente alojados en GitHub. ^{[ 15 ]} El paquete fastDDM incorpora algoritmos acelerados por GPU que reducen el tiempo de análisis de minutos a segundos por conjunto de datos, lo que permite un análisis de alto rendimiento y aplicaciones prácticas que antes estaban limitadas por restricciones computacionales. ^{[ 11 ]} Se proporcionan ejemplos resueltos y cuadernos de tutoriales en un repositorio complementario. ^{[ 16 ]} Los conjuntos de datos abiertos de ejemplo utilizados en los tutoriales de DDM también están disponibles a través de un conjunto de datos archivado con DOI. ^{[ 17 ]}

El DDM se utilizó inicialmente para caracterizar la dinámica de partículas coloidales que experimentan movimiento browniano en suspensiones diluidas y concentradas, extrayendo coeficientes de difusión y otros parámetros hidrodinámicos a partir de la dependencia del vector de onda de las tasas de decorrelación. ^{[ 1 ] [ 2 ]}

El DDM se ha extendido para medir la dinámica en fluidos complejos, incluidos los procesos de agregación de nanopartículas y la dinámica de coloides anisotrópicos. ^{[ 18 ] [ 19 ]}

DDM se ha aplicado ampliamente para cuantificar el movimiento y la motilidad bacteriana, proporcionando parámetros promediados en conjunto, como la velocidad de natación de la población, la difusividad y las estadísticas de carrera-giro sin seguimiento de partículas individuales. ^{[ 3 ] [ 4 ]} Las implementaciones confocales y de fluorescencia permiten además mediciones en muestras fluorescentes y ópticamente difíciles, incluidos sistemas concentrados y de dispersión múltiple. ^{[ 5 ]}

Las áreas de aplicación seleccionadas incluyen:

Determinación del tamaño y distribución de partículas: El método DDM se puede utilizar para determinar el tamaño de las partículas extrayendo los coeficientes de difusión y convirtiéndolos a tamaños hidrodinámicos mediante la ecuación de Stokes-Einstein . Esto se puede extender a distribuciones de tamaño multimodales y mezclas, donde el método DDM proporciona información sobre el tamaño incluso cuando las partículas individuales no se resuelven. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 20 ]}

Determinación del tamaño de las proteínas y caracterización macromolecular: El método DDM se ha extendido para caracterizar proteínas en concentraciones diluidas de unos pocos miligramos por mililitro, logrando mediciones del radio hidrodinámico con una excelente concordancia con los instrumentos DLS comerciales, requiriendo tan solo microlitros de muestra. ^{[ 21 ]}

Suspensiones turbias y concentradas: DDM se ha utilizado para investigar la dinámica en suspensiones turbias en amplios rangos de concentración y espesor óptico, lo que permite el análisis de muestras que resultan difíciles para las mediciones convencionales de dispersión de luz. ^{[ 22 ]}

Microrreología y viscometría: Se han desarrollado variantes de microrreología sin seguimiento y de viscometría de microlitros utilizando el análisis DDM de fluctuaciones de trazadores, lo que permite determinar la viscosidad o los módulos viscoelásticos a partir de pequeños volúmenes de muestra. ^{[ 23 ] [ 24 ] [ 25 ]}

Dinámica de redes biológicas y citoesqueléticas: DDM se ha aplicado para cuantificar la dinámica en redes de biopolímeros y citoesqueléticas, donde proporciona una vista en el espacio de Fourier de la dinámica de relajación y reordenamiento en secuencias de imágenes de microscopía. ^{[ 26 ]}

Transiciones de fase y ordenamiento orientacional en cristales líquidos: El método DDM se ha aplicado para estudiar la dinámica orientacional y las fluctuaciones pretransicionales en sistemas de cristales líquidos. En celdas nemáticas confinadas, el método DDM captura los cambios en las fluctuaciones del director y las correlaciones dinámicas cerca de los límites de fase, lo que proporciona información sobre la relajación orientacional colectiva y la dinámica anisotrópica en el régimen nemático. ^{[ 27 ] [ 28 ]}

Materiales activos y fuera de equilibrio: DDM se utiliza cada vez más para cuantificar la dinámica multiescala en materiales blandos activos y fuera de equilibrio, incluidos geles ^{[ 29 ]} y sistemas dinámicamente heterogéneos con múltiples regímenes de relajación. Se han aplicado enfoques relacionados del espacio recíproco a coloides vítreos para caracterizar la dinámica heterogénea multiescala en sistemas bidimensionales ^{[ 30 ]} y para investigar la difusión browniana pero no gaussiana de partículas trazadoras en vidrios de esferas duras ^{[ 31 ]} . En materia biológica activa, los métodos derivados de DDM han permitido la cuantificación sin seguimiento de la dinámica celular colectiva, incluidos los desplazamientos de células individuales y las tasas de división en monocapas confluentes ^{[ 32 ] , y se han utilizado para analizar la difusión activa y la advección impulsadas por la actividad del citoesqueleto en el ooplasma de Drosophila [ 33 ]} .

El DDM basado en dispersión pertenece a la familia de dispersión denominada de campo cercano (o Fresnel profundo ), ^{[ 34 ]} una familia de métodos de dispersión basados ​​en imágenes. ^{[ 35 ] [ 36 ]} El campo cercano se utiliza aquí de forma similar a como se utiliza para el moteado de campo cercano , es decir, como un caso particular de la región de Fresnel en contraposición al campo lejano o región de Fraunhofer. La familia de dispersión de campo cercano también incluye la sombreadografía cuantitativa ^{[ 37 ]} y Schlieren . ^{[ 12 ]}