polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción

En biología molecular , el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ( RFLP ) es una técnica que aprovecha las variaciones en secuencias de ADN homólogas , conocidas como polimorfismos , para distinguir individuos, poblaciones o especies y determinar la ubicación de los genes dentro de una secuencia. El término puede referirse al polimorfismo en sí, detectado a través de las diferentes ubicaciones de los sitios de las enzimas de restricción , o a una técnica de laboratorio relacionada que permite visualizar dichas diferencias. En el análisis RFLP , una muestra de ADN se digiere en fragmentos mediante una o más enzimas de restricción , y los fragmentos resultantes se separan mediante electroforesis en gel según su tamaño.

El análisis RFLP está prácticamente obsoleto debido a la aparición de tecnologías de secuenciación de ADN económicas , pero fue la primera técnica de perfilado de ADN lo suficientemente económica como para tener una amplia aplicación. El análisis RFLP fue una herramienta importante en sus inicios para el mapeo del genoma , la localización de genes de trastornos genéticos , la determinación del riesgo de enfermedades y las pruebas de paternidad .

La técnica básica para la detección de RFLP consiste en fragmentar una muestra de ADN mediante la aplicación de una enzima de restricción , que corta selectivamente una molécula de ADN en cualquier punto donde reconozca una secuencia corta y específica , en un proceso conocido como digestión con enzimas de restricción . Los fragmentos de ADN resultantes se separan por longitud mediante electroforesis en gel de agarosa y se transfieren a una membrana mediante la técnica de Southern blot . La hibridación de la membrana con una sonda de ADN marcada determina la longitud de los fragmentos complementarios a la sonda. Se habla de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) cuando la longitud de un fragmento detectado varía entre individuos, lo que indica homologías de secuencia no idénticas. Cada longitud de fragmento se considera un alelo , contenga o no una región codificante , y puede utilizarse en análisis genéticos posteriores.

El análisis de la variación RFLP en los genomas fue una herramienta fundamental en el mapeo genómico y el análisis de enfermedades genéticas. Si los investigadores intentaban determinar la ubicación cromosómica de un gen causante de una enfermedad, analizaban el ADN de los miembros de una familia afectada y buscaban alelos RFLP con un patrón de herencia similar (véase ligamiento genético ). Una vez localizado el gen, el análisis RFLP de otras familias podía revelar quiénes estaban en riesgo de padecer la enfermedad o quiénes eran portadores probables de los genes mutantes. La prueba RFLP se utiliza para la identificación y diferenciación de organismos mediante el análisis de patrones únicos en el genoma. También se emplea para determinar la tasa de recombinación en los loci entre sitios de restricción.

El análisis RFLP también fue la base de los primeros métodos de huella genética , útiles para la identificación de muestras recuperadas de escenas del crimen , la determinación de la paternidad y la caracterización de la diversidad genética o los patrones de reproducción en poblaciones animales.

La técnica para el análisis RFLP es, sin embargo, lenta y engorrosa. Requiere una gran cantidad de ADN de muestra, y el proceso combinado de marcaje de sondas, fragmentación de ADN, electroforesis, transferencia, hibridación, lavado y autorradiografía puede tardar hasta un mes en completarse. Una versión limitada del método RFLP que utilizaba sondas de oligonucleótidos se informó en 1985. ^{[ 1 ]} Los resultados del Proyecto Genoma Humano han reemplazado en gran medida la necesidad del mapeo RFLP, y la identificación de muchos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en ese proyecto (así como la identificación directa de muchos genes y mutaciones de enfermedades) ha reemplazado la necesidad del análisis de ligamiento de enfermedades RFLP (ver genotipado de SNP ). El análisis de alelos VNTR continúa, pero ahora generalmente se realiza mediante métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por ejemplo, los protocolos estándar para la huella genética del ADN implican el análisis de PCR de paneles de más de una docena de VNTR.

El RFLP todavía se utiliza en la selección asistida por marcadores. El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (TRFLP o a veces T-RFLP) es una técnica desarrollada inicialmente para caracterizar comunidades bacterianas en muestras de especies mixtas. La técnica también se ha aplicado a otros grupos, incluidos los hongos del suelo. El TRFLP funciona mediante la amplificación por PCR del ADN utilizando pares de cebadores marcados con etiquetas fluorescentes. Los productos de PCR se digieren con enzimas RFLP y los patrones resultantes se visualizan mediante un secuenciador de ADN. Los resultados se analizan simplemente contando y comparando bandas o picos en el perfil TRFLP, o comparando las bandas de una o más ejecuciones de TRFLP con una base de datos de especies conocidas. Se han desarrollado varias herramientas de software para automatizar el proceso de comparación, ajuste y almacenamiento de datos de los perfiles TRFLP. ^{[ 2 ]}

La técnica es similar en algunos aspectos a la electroforesis en gel con gradiente de temperatura o con gradiente desnaturalizante (TGGE y DGGE).

Los cambios de secuencia directamente relacionados con un RFLP también pueden analizarse más rápidamente mediante PCR. La amplificación puede dirigirse a través del sitio de restricción modificado, y los productos se digieren con la enzima de restricción. Este método se conoce como Secuencia Polimórfica Amplificada Digerida (CAPS). Alternativamente, el segmento amplificado puede analizarse mediante sondas de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO), un proceso que a menudo se puede realizar mediante un simple dot blot .

• Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP)
• RAPD
• Análisis STR

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