Amplificación aleatoria de ADN polimórfico

El ADN polimórfico amplificado al azar ( RAPD ), que se pronuncia "rapid", ^[1] es un tipo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pero los segmentos de ADN que se amplifican son aleatorios. ^[2] El científico que realiza la RAPD crea varios cebadores cortos arbitrarios (10-12 nucleótidos) y luego procede con la PCR utilizando una plantilla grande de ADN genómico, con la esperanza de que los fragmentos se amplifiquen. Al resolver los patrones resultantes, se puede obtener un perfil semi-único a partir de una reacción RAPD.

No se requiere conocimiento de la secuencia de ADN del genoma objetivo, ya que los cebadores se unirán en algún lugar de la secuencia, pero no se sabe exactamente dónde. Esto hace que el método sea popular para comparar el ADN de sistemas biológicos que no han tenido la atención de la comunidad científica, o en un sistema en el que se comparan relativamente pocas secuencias de ADN (no es adecuado para formar un banco de datos de ADNc). Debido a que se basa en una secuencia de plantilla de ADN grande e intacta, tiene algunas limitaciones en el uso de muestras de ADN degradadas. Su poder de resolución es mucho menor que los métodos de comparación de ADN específicos de especies específicos, como las repeticiones cortas en tándem . En los últimos años, RAPD se ha utilizado para caracterizar y rastrear la filogenia de diversas especies de plantas y animales.

Los marcadores RAPD son fragmentos de ADN decámeros (de 10 nucleótidos de longitud) obtenidos a partir de la amplificación por PCR de segmentos aleatorios de ADN genómico con un único cebador de secuencia de nucleótidos arbitraria y que son capaces de diferenciar entre individuos genéticamente distintos, aunque no necesariamente de forma reproducible. Se utilizan para analizar la diversidad genética de un individuo mediante el uso de cebadores aleatorios. Debido a problemas de reproducibilidad de los experimentos, muchas revistas científicas ya no aceptan experimentos basados ​​únicamente en RAPD. El RAPD requiere solo un cebador para la amplificación.

Después de la amplificación con PCR, las muestras se cargan en un gel (agarosa o poliacrilamida) para la electroforesis en gel . Los diferentes tamaños creados mediante la amplificación aleatoria se separarán a lo largo del gel de manera repetible según la fuente de la muestra. Esto crea una huella de ADN distintiva.

A diferencia del análisis PCR tradicional, el RAPD no requiere ningún conocimiento específico de la secuencia de ADN del organismo objetivo: los cebadores de 10 meros idénticos amplificarán o no un segmento de ADN, dependiendo de las posiciones que sean complementarias a la secuencia de los cebadores. Por ejemplo, no se produce ningún fragmento si los cebadores se hibridan demasiado separados o si los extremos 3' de los cebadores no están enfrentados. Por lo tanto, si se ha producido una mutación en el ADN molde en el sitio que anteriormente era complementario al cebador, no se producirá un producto de PCR, lo que dará como resultado un patrón diferente de segmentos de ADN amplificados en el gel.

• Casi todos los marcadores RAPD son dominantes, es decir, no es posible distinguir si un segmento de ADN se amplifica a partir de un locus heterocigoto (1 copia) u homocigoto (2 copias). Los marcadores RAPD codominantes, observados como segmentos de ADN de diferente tamaño amplificados a partir del mismo locus, se detectan solo en raras ocasiones.
• La PCR es una reacción enzimática, por lo tanto, la calidad y la concentración del ADN molde, las concentraciones de los componentes de la PCR y las condiciones del ciclo de PCR pueden influir en gran medida en el resultado. Por lo tanto, la técnica RAPD depende notoriamente del laboratorio y necesita protocolos de laboratorio cuidadosamente desarrollados para ser reproducible.
• Las discordancias entre el cebador y el molde pueden dar como resultado la ausencia total del producto de PCR, así como una cantidad simplemente menor del producto. Por lo tanto, los resultados de RAPD pueden ser difíciles de interpretar, a diferencia del análisis de PCR tradicional.

• Secuencia polimórfica amplificada y escindida
• Marcador genético

• Técnica RAPD+ en los encabezamientos de materias médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.