p14arf

p14ARF (también llamado supresor tumoral ARF , ARF , p14 ^ARF ) es un producto de proteína de marco de lectura alternativo del locus CDKN2A (es decir, el locus INK4a / ARF ). ^{[ 1 ]} p14ARF se induce en respuesta a una estimulación mitogénica elevada , como la señalización de crecimiento aberrante de MYC y Ras (proteína) . ^{[ 2 ]} Se acumula principalmente en el nucléolo donde forma complejos estables con NPM o Mdm2 . Estas interacciones permiten que p14ARF actúe como un supresor tumoral al inhibir la biogénesis de los ribosomas o iniciar la detención del ciclo celular dependiente de p53 y la apoptosis , respectivamente. ^{[ 3 ]} p14ARF es una proteína atípica, en términos de su transcripción, su composición de aminoácidos y su degradación: se transcribe en un marco de lectura alternativo de una proteína diferente, es altamente básica, ^{[ 1 ]} y está poliubiquitinada en el extremo N-terminal . ^{[ 4 ]}

Tanto p16INK4a como p14ARF participan en la regulación del ciclo celular . p14ARF inhibe mdm2 , promoviendo así p53 , que a su vez promueve la activación de p21 , la cual se une e inactiva ciertos complejos ciclina - CDK , los cuales, de otro modo, promoverían la transcripción de genes que llevarían a la célula a través del punto de control G1 _/ S del ciclo celular. La pérdida de p14ARF por una mutación homocigótica en el gen CDKN2A ( INK4A ) conlleva niveles elevados de mdm2 y, por consiguiente, la pérdida de la función de p53 y del control del ciclo celular.

El equivalente en ratones es p19ARF.

El transcrito p14ARF se identificó por primera vez en humanos en 1995, ^{[ 5 ] [ 6 ]} y su producto proteico se confirmó en ratones ese mismo año. ^{[ 7 ]} Su locus genético se encuentra en el brazo corto del cromosoma 9 en humanos y en una ubicación correspondiente en el cromosoma 4 en ratones. ^{[ 1 ]} Se encuentra cerca de los genes de las repeticiones en tándem INK4a e INK4b, que son proteínas de 16 kDa (p16 ^INK4a ) y 15 kDa (p15 ^INK4b ), respectivamente. Estas proteínas INK4 inhiben directamente las quinasas dependientes de ciclina D CDK4 y CDK6 . Hay otros genes INK4 en otros cromosomas, sin embargo, estos no están vinculados al cáncer , por lo que es poco probable que sus funciones se superpongan. Un sustrato importante dependiente de ciclina es la proteína del retinoblastoma Rb, que se fosforila en la fase tardía de la brecha 1 ( fase G1 ), lo que permite la salida de G1. La proteína Rb limita la proliferación celular al bloquear la actividad de los factores de transcripción E2F , que activan la transcripción de los genes necesarios para la replicación del ADN . Cuando Rb es fosforilada por las quinasas dependientes de ciclina D y E durante la fase G1 del ciclo celular, Rb no puede bloquear la transcripción dependiente de E2F, y la célula puede progresar a la fase de síntesis de ADN ( fase S ). ^{[ 8 ]} Por lo tanto, INK4a e INK4b actúan como supresores tumorales al restringir la proliferación mediante la inhibición de las CDK responsables de la fosforilación de Rb . ^{[ 7 ]}

Además de la proteína INK4a, la proteína no relacionada, ARF, se transcribe a partir de un marco de lectura alternativo en el locus INK4a/ARF. ^{[ 1 ]} El ARNm de INK4a y p14ARF consta cada uno de tres exones . Comparten los exones 2 y 3, pero hay dos transcripciones diferentes del exón 1, α y β. El exón 1β (E1β) está intercalado entre los genes de INK4a e INK4b. ^{[ 1 ]} Aunque el exón 1α (E1α) y E1β son aproximadamente iguales en términos de contenido y tamaño, el AUG 5' ( codón de inicio ) del exón 1β tiene su propio promotor y abre un marco de lectura alternativo en el exón 2, de ahí el nombre p14ARF (el exón 3 de ARF no se traduce). Debido a esto, INK4a y p14ARF tienen secuencias de aminoácidos no relacionadas a pesar de superponerse en las regiones codificantes y tienen funciones distintas. Este doble uso de secuencias codificantes no se observa comúnmente en mamíferos, lo que hace de p14ARF una proteína inusual. ^{[ 1 ]} Cuando se encontró el transcrito β de ARF, se pensó que probablemente no codificaría una proteína. ^{[ 5 ] [ 6 ] En humanos, ARF se traduce en la proteína [[p14 ARF} ]] de 14 kDa y 132 aminoácidos , y en ratones, se traduce en la proteína p19 ^Arf de 19 kDa y 169 aminoácidos . ^{[ 1 ]} El segmento de proteína E1β de ARF de ratón y humano es 45% idéntico, con una identidad general de ARF del 50%, en comparación con una identidad del 72% entre el segmento E1α de INK4a de ratón y humano, y una identidad general del 65%. ^{[ 7 ]}

Aunque las proteínas INK4a y ARF son estructural y funcionalmente diferentes, ambas participan en la progresión del ciclo celular . En conjunto, su amplio papel inhibitorio puede ayudar a contrarrestar las señales oncogénicas . Como se mencionó anteriormente, INK4a inhibe la proliferación al permitir indirectamente que Rb permanezca asociado con los factores de transcripción E2F . ARF participa en la activación de p53 al inhibir Mdm2 (HDM2 en humanos). ^{[ 8 ]} Mdm2 se une a p53, inhibiendo su actividad transcripcional. Mdm2 también tiene actividad de ubiquitina ligasa E3 hacia p53 y promueve su exportación del núcleo celular al citoplasma para su degradación. Al antagonizar Mdm2, ARF permite la actividad transcripcional de p53 que conduciría a la detención del ciclo celular o a la apoptosis . Por lo tanto, una pérdida de ARF o p53 otorgaría a las células una ventaja de supervivencia. ^{[ 1 ]}

La función de ARF se ha atribuido principalmente a su mecanismo Mdm2/p53. Sin embargo, ARF también inhibe la proliferación en células que carecen de p53 o de p53 y Mdm2. ^{[ 9 ]} En 2004 se descubrió que una de las funciones de ARF independientes de p53 implica su unión a la nucleofosmina /B23 (NPM). ^{[ 9 ]} NPM es una chaperona ribosómica ácida (proteína) involucrada en el procesamiento prerribosómico y la exportación nuclear independientemente de p53, y se oligomeriza consigo misma y con p14 ^ARF . Casi la mitad de p14 ^{ARF se encuentra en complejos que contienen NPM con una masa molecular alta (de 2 a 5 MDa). La expresión forzada de ARF retrasa el procesamiento temprano del precursor} de ARNr 47S/45S e inhibe la escisión del ARNr 32S. Esto sugiere que p14 ^ARF puede unirse a NPM, inhibiendo el procesamiento del ARNr. ^{[ 9 ]} Las células ARF-nulas tienen un área nucleolar aumentada, una biogénesis de ribosomas aumentada y un aumento correspondiente en la síntesis de proteínas . ^{[ 10 ]} El mayor tamaño resultante de más ribosomas y proteínas no está asociado con una mayor proliferación, sin embargo, y este fenotipo ARF-nulo ocurre incluso cuando los niveles basales normales de Arf suelen ser bajos. La inactivación de ARF con siRNA al exón 1β da como resultado un aumento de los transcritos de ARNr, el procesamiento de ARNr y la exportación nuclear de ribosomas. La biogénesis de ribosomas descontrolada que se observa cuando NPM no está unido a ARF no ocurre si NPM también está ausente. Aunque la inducción de ARF en respuesta a señales oncogénicas se considera de importancia primordial, los bajos niveles de ARF que se observan en las células en interfase también tienen un efecto considerable en términos de mantener el crecimiento celular bajo control. Por lo tanto, la función del nivel basal de ARF en el complejo NPM/ARF parece ser monitorear la biogénesis de ribosomas en estado estacionario y el crecimiento independientemente de prevenir la proliferación. ^{[ 10 ]}

Es muy común que el cáncer se asocie con una pérdida de función de INK4a, ARF, Rb o p53 . ^{[ 11 ]} Sin INK4a, Cdk4/6 puede fosforilar Rb de forma inapropiada, lo que conduce a una mayor transcripción dependiente de E2F . Sin ARF, Mdm2 puede inhibir p53 de forma inapropiada, lo que conduce a una mayor supervivencia celular.

Se ha descubierto que el locus INK4a/ARF está delecionado o silenciado en muchos tipos de tumores. Por ejemplo, de 100 carcinomas mamarios primarios, aproximadamente el 41% tiene defectos en p14 ^{ARF . [ 12 ]} En un estudio aparte, se encontró que el 32% de los adenomas colorrectales (tumores no cancerosos) tenían inactivación de p14 ^ARF debido a la hipermetilación del promotor . Los modelos de ratón que carecen de p19 ^Arf , p53 y Mdm2 son más propensos al desarrollo de tumores que los ratones que carecen solo de Mdm2 y p53. Esto sugiere que p19 ^Arf también tiene efectos independientes de Mdm2 y p53. ^{[ 13 ]} La investigación de esta idea condujo al reciente descubrimiento de smARF. ^{[ 14 ]}

Se ha descubierto que las deleciones homocigóticas y otras mutaciones de CDK2NA (ARF) están asociadas con el glioblastoma . ^{[ 15 ]}

Hasta hace poco, los dos efectos conocidos de ARF eran la inhibición del crecimiento mediante interacciones con NPM y la inducción de apoptosis mediante interacciones con Mdm2 . La función de ARF que implica la muerte celular independiente de p53 se ha atribuido ahora a la isoforma mitocondrial pequeña de ARF, smARF. ^{[ 14 ]} Mientras que la ARF de longitud completa inhibe el crecimiento celular mediante la detención del ciclo celular o la muerte apoptótica de tipo I , smARF mata las células mediante la muerte autofágica de tipo II. Al igual que ARF, la expresión de smARF aumenta cuando hay señales de proliferación aberrantes. Cuando smARF se sobreexpresa, se localiza en la matriz mitocondrial , dañando el potencial de membrana y la estructura mitocondrial, y provocando la muerte celular autofágica. ^{[ 16 ]}

La traducción de la ARF truncada, smARF, se inicia en una metionina interna (M45) del transcrito de ARF en células humanas y de ratón. SmARF también se detecta en ratas, aunque no hay una metionina interna en el transcrito de rata. Esto sugiere que existe un mecanismo alternativo para formar smARF, lo que subraya la importancia de esta isoforma . ^{[ 14 ]} La función de smARF es distinta a la de ARF, ya que carece de la señal de localización nuclear (NLS) y no puede unirse a Mdm2 ni a NPM. ^{[ 3 ]} Sin embargo, en algunos tipos de células, la ARF de longitud completa también puede localizarse en las mitocondrias e inducir la muerte celular de tipo II, lo que sugiere que, además de que la autofagia sea una respuesta a la inanición u otro entorno, también puede estar implicada en la respuesta a la activación de oncogenes . ^{[ 2 ]}

La expresión de ARF está regulada por la señalización oncogénica . La estimulación mitogénica aberrante , como la producida por MYC o Ras (proteína) , aumentará su expresión, al igual que la amplificación de p53 mutado o Mdm2 , o la pérdida de p53. ^{[ 8 ]} ARF también puede ser inducida por la expresión forzada de E2F . Aunque la expresión de E2F aumenta durante el ciclo celular , la expresión de ARF probablemente no lo haga porque podría ser necesaria la activación de un segundo factor de transcripción desconocido para prevenir una respuesta de ARF a los aumentos transitorios de E2F. ^{[ 11 ]} ARF está regulada negativamente por los complejos Rb-E2F ^{[ 11 ]} y por la activación amplificada de p53. ^{[ 8 ]} Las señales de crecimiento aberrantes también aumentan la expresión de smARF. ^{[ 16 ]}

ARF es una proteína altamente básica (pI>12) e hidrofóbica . ^{[ 8 ]} Su naturaleza básica se atribuye a su contenido de arginina; más del 20% de sus aminoácidos son arginina, y contiene poca o ninguna lisina. Debido a estas características, es probable que ARF no tenga estructura definida a menos que se una a otros objetivos. Se ha informado que forma complejos con más de 25 proteínas, aunque se desconoce la importancia de cada una de estas interacciones. ^{[ 1 ]} Una de estas interacciones da como resultado una actividad sumoilante, lo que sugiere que ARF puede modificar las proteínas a las que se une. La proteína SUMO es un pequeño modificador similar a la ubiquitina , que se añade a los grupos ε-amino de la lisina. Este proceso implica una cascada de tres enzimas similar a la forma en que ocurre la ubiquitinación . E1 es una enzima activadora, E2 es una enzima de conjugación y E3 es una ligasa. ARF se asocia con UBC9, la única SUMO E2 conocida, lo que sugiere que ARF facilita la conjugación de SUMO. Se desconoce la importancia de esta función, ya que la sumoilación está implicada en diversas funciones, como el tráfico de proteínas, la interferencia de la ubiquitinación y los cambios en la expresión génica. ^{[ 1 ]}

La vida media de ARF es de aproximadamente 6 horas, ^{[ 4 ]} mientras que la vida media de smARF es menor a 1 hora. ^{[ 3 ]} Ambas isoformas se degradan en el proteasoma . ^{[ 1 ] [ 4 ]} ARF es dirigida al proteasoma por ubiquitinación del extremo N. ^{[ 4 ]} Las proteínas generalmente se ubiquitinan en residuos de lisina . Sin embargo, la [ [p14 ^ARF ]] humana no contiene ninguna lisina, y la p19 ^Arf de ratón solo contiene una lisina. Si la lisina del ratón se reemplaza por arginina, no hay efecto en su degradación, lo que sugiere que también se ubiquitina en el extremo N. Esto aumenta la singularidad de las proteínas ARF, porque la mayoría de las proteínas eucariotas están acetiladas en el extremo N , lo que impide la ubiquitinación en esta ubicación. Los residuos penúltimos afectan la eficiencia de la acetilación, ya que esta se ve favorecida por los residuos ácidos e inhibida por los básicos. Las secuencias de aminoácidos N-terminales de p19 ^Arf (Met-Gly-Arg) y p14 ^ARF (Met-Val-Arg) serían procesadas por la metionina aminopeptidasa, pero no se acetilarían, lo que permitiría que se produjera la ubiquitinación. Sin embargo, la secuencia de smARF predice que la metionina inicial no sería escindida por la metionina aminopeptidasa y probablemente se acetilaría, por lo que sería degradada por el proteasoma sin ubiquitinación. ^{[ 1 ]}

La proteína ARF nucleolar de longitud completa parece estar estabilizada por NPM. El complejo NPM-ARF no bloquea el extremo N-terminal de ARF, pero probablemente lo protege del acceso de la maquinaria de degradación. ^{[ 4 ]} La proteína de la matriz mitocondrial p32 estabiliza smARF. ^{[ 16 ]} Esta proteína se une a diversas proteínas celulares y virales, pero se desconoce su función exacta. La reducción de la expresión de p32 disminuye drásticamente los niveles de smARF al aumentar su recambio. Los niveles de p19 ^Arf no se ven afectados por la reducción de la expresión de p32, por lo que p32 estabiliza específicamente smARF, posiblemente protegiéndolo del proteasoma o de las proteasas mitocondriales . ^{[ 16 ]}

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