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Marcador de linaje neuronal

Un marcador de linaje neuronal es una etiqueta endógena que se expresa en diferentes células durante la neurogénesis y en células diferenciadas como las neuronas . Permite la de...

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Un marcador de linaje neuronal es una etiqueta endógena que se expresa en diferentes células durante la neurogénesis y en células diferenciadas como las neuronas . Permite la detección e identificación de células mediante diversas técnicas. Un marcador de linaje neuronal puede ser ADN, ARNm o ARN expresado en una célula de interés. También puede ser una etiqueta proteica , ya sea una proteína parcial, una proteína completa o un epítopo que discrimine entre diferentes tipos celulares o diferentes estados de una célula común. Un marcador ideal es específico para un tipo celular determinado en condiciones normales y/o durante una lesión. Los marcadores celulares son herramientas muy valiosas para examinar la función de las células tanto en condiciones normales como durante una enfermedad. El descubrimiento de diversas proteínas específicas de ciertas células condujo a la producción de anticuerpos específicos para cada tipo celular, que se han utilizado para identificar células. [ 1 ]

Las técnicas utilizadas para su detección pueden ser inmunohistoquímica , inmunocitoquímica , métodos que utilizan moduladores transcripcionales y recombinasas sitio-específicas para marcar poblaciones neuronales específicas, [ 2 ] hibridación in situ o hibridación fluorescente in situ (FISH). [ 3 ] Un marcador de linaje neuronal puede ser un antígeno neuronal que es reconocido por un autoanticuerpo, por ejemplo Hu , que está altamente restringido a los núcleos neuronales. Mediante inmunohistoquímica, el anti-Hu tiñe los núcleos de las neuronas. [ 4 ] Para localizar el ARNm en el tejido cerebral, se puede utilizar un fragmento de ADN o ARN como marcador de linaje neuronal, una sonda de hibridación que detecta la presencia de secuencias de nucleótidos que son complementarias a la secuencia en la sonda. Esta técnica se conoce como hibridación in situ . Su aplicación se ha llevado a cabo en todos los diferentes tejidos, pero es particularmente útil en neurociencia . Utilizando esta técnica, es posible localizar la expresión génica en tipos celulares específicos en regiones específicas y observar cómo ocurren los cambios en esta distribución a lo largo del desarrollo y correlacionarlos con manipulaciones conductuales. [ 5 ]

Ejemplos de marcadores que se expresan en diferentes etapas de la neurogénesis en el hipocampo adulto.

Aunque la inmunohistoquímica es la metodología básica para identificar tipos de células neuronales, debido a su costo relativamente bajo y a la amplia gama de marcadores inmunohistoquímicos disponibles para distinguir el fenotipo de las células cerebrales, a veces la producción de un buen anticuerpo requiere mucho tiempo. [ 6 ] Por lo tanto, uno de los métodos más convenientes para la evaluación rápida de la expresión de un canal iónico clonado podría ser la hibridación in situ.

Una vez aisladas las células del tejido o diferenciadas a partir de precursores pluripotentes , es necesario caracterizar la población resultante para confirmar si se ha obtenido la población deseada. Según el objetivo del estudio, se pueden utilizar marcadores de células madre neurales , marcadores de células progenitoras neurales , marcadores neuronales o marcadores neuronales del sistema nervioso periférico .

Historia

El estudio del sistema nervioso se remonta al antiguo Egipto, pero no fue hasta el siglo XIX que se volvió más detallado. Con la invención del microscopio y una técnica de tinción desarrollada por Camillo Golgi , fue posible estudiar neuronas individuales. Este científico comenzó a impregnar el tejido nervioso con un metal, como la plata. La reacción consiste en fijar partículas de cromato de plata al neurilema , y ​​resultó en un depósito negro intenso en el soma, el axón y las dendritas de la neurona. Así, fue posible identificar diferentes tipos de neuronas, como la célula de Golgi , Golgi I y Golgi II . [ 7 ] En 1885, un investigador médico alemán llamado Franz Nissl desarrolló otra técnica de tinción ahora conocida como tinción de Nissl . Esta técnica es ligeramente diferente de la tinción de Golgi, ya que tiñe el cuerpo celular y el retículo endoplasmático. [ 8 ] En 1887, un científico español llamado Santiago Ramón y Cajal aprendió la técnica de tinción con Golgi y comenzó su famoso trabajo de neuroanatomía . [ 9 ] Con esta técnica realizó un estudio extenso de varias áreas del cerebro y en diferentes especies. También describió con gran precisión las células de Purkinje , el cerebelo del pollo y el circuito neuronal del hipocampo del roedor . En 1941, el Dr. Albert Coons utilizó por primera vez una técnica revolucionaria que utiliza el principio de los anticuerpos que se unen específicamente a antígenos en los tejidos. Creó una técnica de inmunofluorescencia para marcar los anticuerpos. [ 10 ] Esta técnica continúa siendo ampliamente utilizada en estudios de neurociencia para identificar diferentes estructuras. Los marcadores neuronales más importantes utilizados hoy en día son los anticuerpos GFAP, Nestina, NeuroD y otros. [ 11 ] En los últimos años se siguen creando nuevos marcadores neuronales para inmunocitoquímica y/o inmunohistoquímica . En 1953, Heinrich Klüver inventó una nueva técnica de tinción llamada tinción de Luxol Fast Blue o LFB, y con esta técnica es posible detectar la desmielinización en el sistema nervioso central. La vaina de mielina se teñirá de azul, pero otras estructuras se teñiránAsimismo, la siguiente técnica revolucionaria fue inventada en 1969 por el científico estadounidense Joseph G. Gall . [ 12 ] Esta técnica se denomina hibridación in situ y se utiliza en una amplia variedad de estudios, principalmente en biología del desarrollo. Con ella es posible marcar ciertos genes que se expresan en áreas específicas del animal. En neurobiología , resulta muy útil para comprender la formación del sistema nervioso.

Técnicas

Hibridación in situ

Hibridación in situ de ARN: KRT5 y gen de mantenimiento en una sección de tejido de melanoma humano FFPE, visualizado bajo microscopio de campo claro y fluorescencia.

Esta es una de las técnicas más potentes para marcar células. Este método consiste en hibridar una cadena de ADN o ARN complementario marcado con un ADN o ARN específico en el tejido. Mediante esta hibridación podremos revelar la ubicación de un ARNm específico , lo que nos proporcionará información sobre el proceso fisiológico de organización, regulación y función de los genes. [ 13 ]

Utilizando esta técnica, ahora podemos saber cuáles son los genes y las proteínas que están detrás de un cierto proceso, como la formación de la cresta neural , o un comportamiento específico; y cuál es la ubicación de esos mismos genes. También podemos ver cómo los cambios en la distribución de estos genes pueden afectar el desarrollo de un tejido y correlacionarlo con manipulaciones del comportamiento. [ 13 ] Algunos ejemplos son el uso de sondas de oligonucleótidos conjugadas con digoxigenina o fluoróforo , para la detección de ARNm localizados en dendritas, espinas, axones y conos de crecimiento de neuronas cultivadas; o sondas de ARN marcadas con digoxigenina y amplificación de tiramida fluorescente para la detección de ARNm menos abundantes localizados en dendritas in vivo. [ 14 ] Estos ejemplos utilizan FISH (hibridación fluorescente in situ). Con esta técnica podemos comprender los procesos fisiológicos y las enfermedades neurológicas.

Corte de cerebro de ratón teñido mediante inmunohistoquímica.

Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica es una técnica que utiliza anticuerpos con marcadores fluorescentes que se dirigen a un antígeno específico presente en una proteína determinada. Esta alta especificidad nos permite localizar los neurotransmisores peptídicos y clásicos, sus enzimas sintéticas y otros antígenos específicos de células en el tejido neuronal.

Un ejemplo de la aplicación de esta técnica en neurociencia es el inmunomarcaje de antígenos como la glicoproteína externa grande inducible por NGF ( NILE-GF ), la colina acetiltransferasa , la parvalbúmina y la proteína de neurofilamento . [ 15 ] Todos estos antígenos están presentes en tipos celulares neuronales específicos. Con ellos podemos definir circuitos anatómicos con un alto grado de resolución y comprender la función de algunas proteínas y células en el sistema nervioso, así como la ubicación de dichas proteínas y células.

Si bien esta es una técnica muy potente, presenta algunos inconvenientes. El procedimiento es de naturaleza no cuantificable y puede generar tanto falsos positivos como falsos negativos. [ 16 ]

Inmunocitoquímica

La inmunocitoquímica utiliza el mismo método que la inmunohistoquímica, pero con la diferencia de que esta técnica se emplea en células aisladas en cultivo, mientras que la otra se aplica a tejidos. Los resultados son los mismos, pero con mayor resolución, ya que se analiza una sola célula.

marcadores de linaje

Marcadores de células madre neurales

Las células madre neurales son un ejemplo de células madre somáticas presentes en diversos tejidos, tanto durante el desarrollo como en la edad adulta. Poseen dos características fundamentales: son autorrenovables y, tras su división y diferenciación terminal, pueden dar origen a toda la gama de clases celulares dentro del tejido correspondiente. Por lo tanto, una célula madre neural puede dar origen a otra célula madre neural o a cualquiera de los tipos celulares diferenciados presentes en los sistemas nerviosos central y periférico ( neuronas inhibitorias y excitatorias , astrocitos y oligodendrocitos ). [ 17 ]

El método estándar para aislar células madre neurales in vitro es el sistema de cultivo de neuroesferas , el método utilizado originalmente para identificar las CNM. Tras cierta proliferación, las células se inducen a diferenciarse retirando los mitógenos o exponiéndolas a otro factor que induce el desarrollo de algunas células en diferentes linajes. [ 18 ] Los destinos celulares se analizan mediante tinción con anticuerpos dirigidos contra antígenos específicos de astrocitos, oligodendrocitos y neuronas. En algunos casos, las células se siembran a baja densidad y se monitorizan para determinar si una sola célula puede dar lugar a los tres fenotipos. [ 19 ] Se han aplicado estrategias de separación celular inmunomagnética utilizando anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie celular presentes en células madre, progenitoras y células maduras del SNC al estudio de las CNM. Se han utilizado otros métodos no inmunológicos para identificar poblaciones de células de tejidos del SNC normales y tumorigénicos, que demuestran algunas de las propiedades in vitro de las células madre, incluida una alta actividad de la enzima aldehído deshidrogenasa (ALDH). Se han aislado células ALDH del SNC embrionario de rata y ratón, y se ha demostrado que tienen la capacidad de generar neuroesferas, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos in vitro, así como neuronas in vivo cuando se trasplantan a la corteza cerebral del ratón adulto. [ 18 ] Una vez que una célula madre se divide asimétricamente, nace el progenitor más maduro y migra a regiones de diferenciación. A medida que el progenitor migra, madura aún más hasta que llega a un sitio donde se detiene y entra en estado de quiescencia o se diferencia completamente en una célula funcional. El principal obstáculo para identificar y descubrir marcadores que definan una célula madre es que las células más primitivas probablemente se encuentran en un estado de quiescencia y no expresan muchos antígenos únicos. Por lo tanto, como en otros campos como la hematopoyesis , se requerirá una combinación de marcadores positivos y negativos para definir mejor la célula madre del sistema nervioso central. [ 19 ] No obstante, los cambios en los niveles de expresión de moléculas específicas pueden usarse para indicar la presencia de células madre neurales en estudios centrados en la diferenciación posterior hacia linajes neurales específicos. Los marcadores habituales utilizados para las células madre neurales incluyen Nestina y SOX2 . Aunque Nestina se expresa predominantemente en las células madre del sistema nervioso central (SNC), su expresión está ausente en casi todas las células maduras del SNC, por lo que es un marcador eficiente para las células madre neurales. [ 20 ] Durante la neurogénesis, Sox2 se expresa en todas las células en desarrollo del tubo neural, así como en los progenitores del SNC en proliferación, por lo que se cree que es de vital importancia para la proliferación y diferenciación de las células madre neurales. [ 20 ] Además de las moléculas intracelulares, hay productos disponibles para estudiar las proteínas que se expresan en la superficie celular, incluidas ABCG2 , FGF R4 y Frizzled-9 .

Marcadores de diferenciación

La diferenciación de las células madre neurales está controlada, de manera dependiente del contexto, por factores intrínsecos y moléculas de señalización extracelular que actúan como reguladores positivos o negativos que pueden usarse como marcadores. [ 21 ]

Marcadores de progenitores neuronales

Una célula progenitora neural se distingue de una célula madre neural, ya que es incapaz de autorrenovarse continuamente y generalmente tiene la capacidad de generar solo una clase de progenie diferenciada. Son células tripotentes que pueden dar origen a neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Una célula progenitora oligodendroglial, por ejemplo, genera oligodendrocitos hasta que se agota su capacidad mitótica. [ 17 ] Algunos marcadores de progenitores neurales permiten rastrear las células a medida que se expanden y diferencian desde rosetas hasta neuronas. La roseta neural es la señal de desarrollo de los neuroprogenitores en cultivos de células madre embrionarias en diferenciación; las rosetas son arreglos radiales de células columnares que expresan muchas de las proteínas expresadas en las células neuroepiteliales del tubo neural. Se ha demostrado que las células dentro de las rosetas expresan múltiples marcadores celulares, incluyendo, entre otros, Nestina , NCAM y Musashi-1 , una proteína de unión a ARN que se expresa en células madre neurales proliferantes. [ 22 ] Los progenitores neuroepiteliales (NEP) son responsables de la neurogénesis en el tubo neural y también dan origen a otros dos tipos de células progenitoras neurales: la glía radial y los progenitores basales. La glía radial es el tipo de célula progenitora dominante en el cerebro en desarrollo, mientras que los progenitores basales se localizan específicamente en la zona subventricular (SVZ) del telencéfalo en desarrollo . Aunque los estudios funcionales de la glía radial están aumentando, es difícil distinguirlos de los neuroprogenitores y los astrocitos. Al igual que los neuroprogenitores, la glía radial expresa la proteína de filamento intermedio nestina, así como el factor de transcripción PAX6, que se expresa en algunos neuroprogenitores de la mitad ventral del tubo neural. La glía radial también expresa proteínas características de los astrocitos, incluida la proteína ácida fibrilar glial ( GFAP ), ampliamente utilizada, entre otras. Los marcadores citológicos que podrían ser exclusivos de la glía radial incluyen formas modificadas de nestina identificadas por los anticuerpos RC1 y RC2 que reconocen los antígenos murinos. [ 23 ]

Marcadores neuronales

Los marcadores pueden detectar neuronas en diferentes etapas de desarrollo a partir de productos nucleares, citoplasmáticos, de membrana o perisinápticos presentes en las neuronas. También es posible marcar específicamente neuronas colinérgicas , dopaminérgicas , serotoninérgicas , GABAérgicas o glutamatérgicas . [ 24 ] Los marcadores pan-neuronales tienen múltiples dianas (proteínas somáticas, nucleares, dendríticas, espinosas y axónicas) y, en consecuencia, marcan todas las partes de la neurona. Se utilizan para estudiar la morfología neuronal, aunque existen marcadores específicos que marcan regiones particulares de la neurona. [ 25 ]

La doblecortina (DCX) es una proteína asociada a los microtúbulos que se expresa ampliamente en el soma y las prolongaciones principales de las neuronas migratorias y en los axones de las neuronas en diferenciación. Su expresión disminuye con la maduración [ 26 ].

La β-tubulina de clase III específica de neuronas (TuJ1) está presente en neuronas posmitóticas inmaduras recién generadas y en neuronas diferenciadas, así como en algunos precursores neuronales mitóticamente activos. [ 11 ]

La proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP-2) es una proteína del citoesqueleto. Su expresión es débil en los precursores neuronales, pero aumenta durante el proceso de desarrollo neuronal. En general, su expresión se limita a las neuronas y los astrocitos reactivos. [ 15 ]

La enolasa específica de neuronas (NSE), también llamada gamma-enolasa o enolasa 2, es una proteína citosólica que se expresa en neuronas maduras. Los niveles de NSE aumentan a lo largo del desarrollo neuronal, alcanzando niveles más altos en etapas posteriores. Puede expresarse en células gliales durante la diferenciación de oligodendrocitos con los mismos niveles que se han encontrado en cultivos neuronales, pero se reprime cuando las células maduran. En condiciones patológicas, también se ha informado que las neoplasias gliales y las células gliales reactivas expresan este marcador. [ 15 ]

La calretinina está ampliamente distribuida en diferentes poblaciones neuronales de la retina de los vertebrados, siendo un marcador valioso para las neuronas postmitóticas inmaduras. [ 11 ]

El antígeno de núcleos neuronales ( NeuN ) o Fox-3 es una proteína nuclear presente en células postmitóticas, en el punto de diferenciación hacia células maduras. [ 27 ] Puede utilizarse para detectar casi todos los tipos de células neuronales, excepto las células de Purkinje, las células mitrales del bulbo olfatorio, los fotorreceptores retinianos y las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra . [ 15 ]

La calbindina es expresada por las células de Purkinje del cerebelo y las células granulares del hipocampo. [ 11 ] La reorganización y migración de las neuronas de Purkinje teñidas con calbindina en el cerebelo de rata después de una lesión del nervio periférico sugiere que la calbindina puede ser un marcador de neuronas posmitóticas inmaduras, similar a la calretinina. [ 28 ]

La tirosina hidroxilasa (TH) es una enzima implicada en la síntesis de dopamina y noradrenalina . Generalmente, se utiliza como marcador de neuronas dopaminérgicas, pero también puede encontrarse en algunas neuronas del prosencéfalo que producen noradrenalina (producto de la dopamina y la enzima dopamina β-hidroxilasa). [ 29 ]

La colina acetiltransferasa (ChAT) se expresa en las neuronas colinérgicas tanto del SNC como del SNP. En el SNC, la ChAT se expresa en las motoneuronas y las neuronas autonómicas preganglionares de la médula espinal, un subconjunto de neuronas en el neoestriado y en el prosencéfalo basal . Por otro lado, en el SNP está presente en un pequeño grupo de neuronas simpáticas y en todas las neuronas parasimpáticas. [ 30 ]

El GABA es un marcador neuronal maduro expresado en las interneuronas GABAérgicas (neuronas inhibidoras que generalmente son interneuronas en el cerebro). GAD65/67 son dos enzimas involucradas en la síntesis de GABA por las interneuronas GABAérgicas. [ 29 ]

La proteína precursora amiloide (APP), la proteína central en la enfermedad de Alzheimer, se expresa de forma diferente durante la diferenciación neuronal. La expresión de las isoformas 695 y 714 de APP se incrementa en las neuronas postmitóticas bien diferenciadas, mientras que la isoforma 770 se reduce. Esta dinámica proporciona información valiosa sobre el estado de diferenciación de las neuronas, lo que facilita la identificación y el estudio de las etapas de desarrollo y maduración neuronal. [ 31 ]

Investigación clínica

Los marcadores de linaje neuronal pueden utilizarse en la investigación clínica para identificar células enfermas y/o en el proceso de reparación. Dado que la degeneración selectiva de neuronas funcionales está asociada con la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos , como la degeneración de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo en la enfermedad de Parkinson , las neuronas colinérgicas del prosencéfalo en la enfermedad de Alzheimer y las neuronas GABAérgicas corticales en la esquizofrenia , los marcadores del fenotipo de las células neuronales son de particular interés debido a su utilidad para comprender la patología de la enfermedad clínica. [ 32 ] Hay dos marcadores clave en estos estudios: la colina acetiltransferasa y la tirosina hidroxilasa . La colina acetiltransferasa (ChAT) es una enzima responsable de catalizar la síntesis de acetilcolina y se expresa en la mayoría de las neuronas colinérgicas. Por lo tanto, la inmunorreactividad de ChAT se utiliza para detectar el deterioro cognitivo en varios trastornos neurodegenerativos. [ 15 ] En las regiones motoras, la corteza sensorial y el prosencéfalo basal, este inmunomarcaje se ha aplicado para evaluar las alteraciones en las neuronas colinérgicas de la red de fibras ChAT y también para la morfología general. [ 33 ] El inmunomarcaje de tirosina hidroxilasa (TH) ha sido muy útil para la investigación de la enfermedad de Parkinson. Se utiliza para determinar la cantidad de pérdida de células dopaminérgicas en pacientes con Parkinson.

Ejemplos de marcadores de linaje neuronal

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