Examen de alto contenido

El cribado de alto contenido (HCS), también conocido como análisis de alto contenido (HCA) o celómica , es un método que se utiliza en la investigación biológica y el descubrimiento de fármacos para identificar sustancias como moléculas pequeñas , péptidos o ARNi que alteran el fenotipo de una célula de la manera deseada. ^{[ 1 ] [ 2 ]} Por lo tanto, el cribado de alto contenido es un tipo de cribado fenotípico realizado en células que implica el análisis de células completas o componentes de células con lectura simultánea de varios parámetros. ^{[ 3 ]} El HCS está relacionado con el cribado de alto rendimiento (HTS), en el que miles de compuestos se prueban en paralelo para su actividad en uno o más ensayos biológicos, pero implica ensayos de fenotipos celulares más complejos como resultados. ^{[ 4 ]} Los cambios fenotípicos pueden incluir aumentos o disminuciones en la producción de productos celulares como proteínas y/o cambios en la morfología (apariencia visual) de la célula. Por lo tanto, el HCA generalmente implica microscopía automatizada y análisis de imágenes. ^{[ 4 ]} A diferencia del análisis de alto contenido, el cribado de alto contenido implica un nivel de rendimiento, razón por la cual el término "cribado" diferencia el HCS del HCA, que puede tener un alto contenido pero un bajo rendimiento.

En el cribado de alto contenido, las células se incuban primero con la sustancia y, tras un periodo de tiempo, se analizan sus estructuras y componentes moleculares. El análisis más común consiste en marcar las proteínas con marcadores fluorescentes y, finalmente, medir los cambios en el fenotipo celular mediante análisis de imagen automatizado . Mediante el uso de marcadores fluorescentes con diferentes máximos de absorción y emisión, es posible medir varios componentes celulares diferentes en paralelo. Además, la obtención de imágenes permite detectar cambios a nivel subcelular (p. ej., citoplasma frente a núcleo frente a otros orgánulos ). Por lo tanto, se puede recopilar un gran número de puntos de datos por célula. Además del marcaje fluorescente, se han utilizado diversos ensayos sin marcaje en el cribado de alto contenido. ^{[ 5 ]}

El cribado de alto contenido (HCS) en sistemas basados ​​en células utiliza células vivas como herramientas en la investigación biológica para dilucidar el funcionamiento de células normales y enfermas. El HCS también se utiliza para descubrir y optimizar nuevos fármacos candidatos. El cribado de alto contenido es una combinación de la biología celular moderna , con todas sus herramientas moleculares, con microscopía automatizada de alta resolución y manipulación robótica. Las células se exponen primero a sustancias químicas o reactivos de ARN de interferencia (ARNi) . Luego, se detectan cambios en la morfología celular mediante análisis de imágenes . Los cambios en las cantidades de proteínas sintetizadas por las células se miden utilizando una variedad de técnicas, como las proteínas fluorescentes verdes fusionadas a proteínas endógenas o mediante anticuerpos fluorescentes .

Esta tecnología puede utilizarse para determinar si un fármaco potencial modifica el curso de una enfermedad. Por ejemplo, en humanos, los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) constituyen una amplia familia de aproximadamente 880 proteínas de la superficie celular que transducen cambios extracelulares en el entorno, generando una respuesta celular, como el aumento de la presión arterial debido a la liberación de una hormona reguladora en el torrente sanguíneo. La activación de estos GPCR puede implicar su entrada en las células, y cuando esto se puede visualizar, puede servir de base para un análisis sistemático de la función del receptor mediante genética química , cribado genómico sistemático o manipulación fisiológica.

A nivel celular, la principal ventaja de este método, en comparación con el cribado de alto rendimiento (HCS), es la adquisición paralela de datos sobre diferentes propiedades celulares, como la actividad de las cascadas de transducción de señales y la integridad del citoesqueleto . Si bien el HCS es más lento, la gran cantidad de datos obtenidos permite una comprensión más profunda de los efectos de los fármacos.

El cribado automatizado basado en imágenes permite la identificación de compuestos pequeños que alteran los fenotipos celulares y es de interés para el descubrimiento de nuevos fármacos y nuevas herramientas de biología celular para modificar la función celular. La selección de moléculas basada en un fenotipo celular no requiere un conocimiento previo de las dianas bioquímicas afectadas por los compuestos. Sin embargo, la identificación de la diana biológica facilitará significativamente la posterior optimización preclínica y el desarrollo clínico del compuesto identificado. Dado el aumento en el uso del cribado fenotípico/visual como herramienta de biología celular, se requieren métodos que permitan la identificación sistemática de la diana bioquímica para que estas moléculas tengan un uso generalizado. ^{[ 7 ]} La identificación de la diana se ha definido como el paso limitante de la velocidad en la genética química/cribado de alto contenido. ^{[ 8 ]}

La tecnología de cribado de alto rendimiento se basa principalmente en la microscopía digital automatizada y la citometría de flujo , en combinación con sistemas informáticos para el análisis y el almacenamiento de los datos.

La tecnología de biología visual o de alto contenido tiene dos propósitos: primero, adquirir información espacial o temporalmente resuelta sobre un evento y, segundo, cuantificarla automáticamente. Los instrumentos con resolución espacial suelen ser microscopios automatizados , mientras que la resolución temporal aún requiere algún tipo de medición de fluorescencia en la mayoría de los casos. Esto significa que muchos instrumentos de HCS son microscopios ( de fluorescencia ) conectados a algún paquete de análisis de imágenes. Estos se encargan de todos los pasos necesarios para obtener imágenes fluorescentes de las células y proporcionan una evaluación rápida, automatizada e imparcial de los experimentos.

Los instrumentos HCS disponibles actualmente en el mercado se pueden clasificar según una serie de especificaciones que influyen significativamente en su versatilidad y coste total. Estas incluyen velocidad, una cámara para células vivas con control de temperatura y _CO₂ ( algunos también controlan la humedad para la obtención de imágenes de células vivas a largo plazo), un pipeteador o inyector integrado para ensayos cinéticos rápidos y modos de imagen adicionales como confocal, campo claro, contraste de fase y FRET. Una de las diferencias más importantes radica en si los instrumentos son confocales ópticos o no. La microscopía confocal consiste en obtener imágenes de una sección delgada de un objeto y rechazar la luz desenfocada que proviene del exterior. La microscopía confocal permite una mayor relación señal-ruido y una mayor resolución que la microscopía de epifluorescencia , más comúnmente utilizada . Dependiendo del instrumento, la confocalidad se logra mediante escaneo láser, un disco giratorio simple con orificios o rendijas, un disco giratorio doble o una rendija virtual. Entre las distintas técnicas confocales existen ventajas y desventajas en cuanto a sensibilidad, resolución, velocidad, fototoxicidad, fotoblanqueo, complejidad del instrumento y precio.

Lo que todos estos instrumentos tienen en común es la capacidad de capturar, almacenar e interpretar imágenes automáticamente, e integrarse en grandes plataformas robóticas para la manipulación de células o medios de cultivo.

Muchas pantallas se analizan con el software de análisis de imágenes que acompaña al instrumento, lo que proporciona una solución integral. Para pantallas especialmente complejas o cuando un laboratorio o centro dispone de varios instrumentos y desea estandarizar su análisis en una única plataforma, se suelen utilizar programas de terceros. Sin embargo, algunos programas permiten la importación y exportación masiva de imágenes y datos, para aquellos usuarios que deseen estandarizar su análisis en una única plataforma sin necesidad de software de terceros.

Esta tecnología permite realizar un gran número de experimentos, posibilitando la selección exploratoria. Los sistemas celulares se utilizan principalmente en genética química, donde se prueban sistemáticamente colecciones extensas y diversas de moléculas pequeñas para evaluar su efecto en sistemas modelo celulares . Mediante la selección de decenas de miles de moléculas, se pueden descubrir nuevos fármacos, lo que resulta prometedor para el futuro del desarrollo de medicamentos .

Más allá del descubrimiento de fármacos, la genética química busca funcionalizar el genoma mediante la identificación de pequeñas moléculas que actúan sobre la mayoría de los 21.000 productos génicos de una célula. La tecnología de alto contenido formará parte de este esfuerzo, proporcionando herramientas útiles para comprender dónde y cuándo actúan las proteínas mediante su inactivación química. Esto sería especialmente útil para genes en los que no se pueden crear ratones knock-in (con uno o varios genes ausentes) porque la proteína es esencial para el desarrollo, el crecimiento o, de otro modo, resulta letal en su ausencia. La inactivación química podría dilucidar cómo y dónde funcionan estos genes.

Además, esta tecnología se utiliza en combinación con la ARN de interferencia (ARNi) para identificar conjuntos de genes implicados en mecanismos específicos, como la división celular. En este caso, se pueden utilizar bibliotecas de ARNi, que abarcan un conjunto completo de genes predichos en el genoma del organismo objetivo, para identificar subconjuntos relevantes, facilitando así la anotación de genes cuya función no se había establecido previamente.

Los grandes conjuntos de datos generados por la biología celular automatizada contienen datos cuantitativos con resolución espacial que pueden utilizarse para construir modelos y simulaciones a nivel de sistemas sobre el funcionamiento de las células y los organismos. Los modelos de biología de sistemas del funcionamiento celular permitirían predecir por qué, dónde y cómo responde la célula a los cambios externos, el crecimiento y las enfermedades.

La tecnología de cribado de alto contenido permite evaluar múltiples parámetros bioquímicos y morfológicos en sistemas biológicos intactos.

En el caso de los enfoques basados ​​en células, la utilidad de la biología celular automatizada exige examinar cómo la automatización y la medición objetiva pueden mejorar la experimentación y la comprensión de las enfermedades. En primer lugar, elimina la influencia del investigador en la mayoría, aunque no en todos, los aspectos de la investigación en biología celular; y en segundo lugar, posibilita enfoques completamente nuevos.

En resumen, la biología celular clásica del siglo XX utilizaba líneas celulares cultivadas in vitro, donde los experimentos se medían de forma muy similar a la descrita aquí, pero en ese caso el investigador decidía qué se medía y cómo. A principios de la década de 1990, el desarrollo de las cámaras de dispositivo de carga acoplada (CCD) para la investigación permitió medir características en imágenes celulares, como la cantidad de proteína en el núcleo o en el exterior. Pronto surgieron mediciones más sofisticadas utilizando nuevas moléculas fluorescentes, que se emplean para medir propiedades celulares como las concentraciones de segundos mensajeros o el pH de los compartimentos celulares internos. El uso generalizado de la proteína verde fluorescente, una molécula de proteína fluorescente natural de las medusas, impulsó la adopción de la microscopía celular como tecnología principal en biología celular. A pesar de estos avances, la elección de qué célula fotografiar, qué datos presentar y cómo analizarlos seguía estando a cargo del investigador.

Por analogía, si imaginamos un campo de fútbol con platos de comida esparcidos sobre él, en lugar de observarlos todos, el investigador elegiría unos pocos cerca de la línea de anotación y dejaría el resto. En esta analogía, el campo es una placa de cultivo celular y los platos, las células que crecen en ella. Si bien este era un enfoque razonable y pragmático, la automatización de todo el proceso y el análisis permite analizar toda la población de células vivas, de modo que se puede medir todo el campo de fútbol.

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• Directrices para el cribado de alto contenido basado en imágenes - NCBI
• La Sociedad de Imagen Biomolecular e Informática