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Citometría de flujo

La citometría de flujo ( CF ) es una técnica utilizada para detectar y medir las características físicas y químicas de una población de células o partículas. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [...

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La citometría de flujo ( CF ) es una técnica utilizada para detectar y medir las características físicas y químicas de una población de células o partículas. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]

En este proceso, una muestra que contiene células o partículas se suspende en un fluido y se inyecta en el citómetro de flujo . La muestra se enfoca para que, idealmente, una célula a la vez fluya a través de un haz láser, donde la luz dispersada es característica de las células y sus componentes. Las células suelen estar marcadas con marcadores fluorescentes para que la luz sea absorbida y luego emitida en una banda de longitudes de onda. Se pueden examinar rápidamente decenas de miles de células y los datos recopilados son procesados ​​por una computadora. [ 5 ]

La citometría de flujo se utiliza habitualmente en la investigación básica, la práctica clínica y los ensayos clínicos . Entre los usos de la citometría de flujo se incluyen:

Un analizador de citometría de flujo es un instrumento que proporciona datos cuantificables a partir de una muestra. Otros instrumentos que utilizan la citometría de flujo incluyen los clasificadores celulares, que separan físicamente y, por lo tanto, purifican las células de interés en función de sus propiedades ópticas.

Historia

El primer dispositivo de citometría de flujo basado en impedancia , que utiliza el principio de Coulter , se divulgó en la patente estadounidense 2,656,508, emitida en 1953, a nombre de Wallace H. Coulter . Mack Fulwyler fue el inventor del precursor de los citómetros de flujo actuales, en particular del clasificador de células. [ 6 ] Fulwyler desarrolló esto en 1965 con su publicación en Science . [ 7 ] El primer dispositivo de citometría de flujo basado en fluorescencia (ICP 11) fue desarrollado en 1968 por Wolfgang Göhde de la Universidad de Münster , se solicitó la patente el 18 de diciembre de 1968 [ 8 ] y se comercializó por primera vez en 1968/69 por el desarrollador y fabricante alemán Partec a través de Phywe AG en Göttingen . En ese momento, los métodos de absorción todavía eran ampliamente preferidos por otros científicos sobre los métodos de fluorescencia . [ 9 ] Poco después, se desarrollaron instrumentos de citometría de flujo, entre ellos el Cytofluorograph (1971) de Bio/Physics Systems Inc. (más tarde: Ortho Diagnostics), el PAS 8000 (1973) de Partec, el primer instrumento FACS (clasificación celular activada por fluorescencia) de Becton Dickinson (1974), el ICP 22 (1975) de Partec/Phywe y el Epics de Coulter (1977/78). El primer citómetro de flujo de impedancia de alta frecuencia sin marcadores basado en un "laboratorio en un chip" microfluídico patentado, Ampha Z30, fue presentado por Amphasys (2012).

Nombre de la tecnología

El nombre original de la tecnología de citometría de flujo basada en fluorescencia era "citofotometría de pulsos" ( en alemán : Impulszytophotometrie ), basado en la primera solicitud de patente sobre citometría de flujo basada en fluorescencia. En la 5.ª Conferencia de la American Engineering Foundation sobre Citología Automatizada, celebrada en Pensacola (Florida) en 1976 —ocho años después de la introducción del primer citómetro de flujo basado en fluorescencia (1968)— se acordó utilizar comúnmente el nombre "citometría de flujo", término que rápidamente se popularizó. [ 10 ]

citómetros de flujo

Diagrama esquemático de un citómetro de flujo, desde el enfoque de la vaina hasta la adquisición de datos.

Los citómetros de flujo modernos pueden analizar miles de partículas por segundo, en tiempo real, y, si se configuran como clasificadores celulares, pueden separar y aislar activamente partículas con propiedades ópticas específicas a velocidades similares. Un citómetro de flujo es similar a un microscopio , con la diferencia de que, en lugar de producir una imagen de la célula, la citometría de flujo ofrece una cuantificación automatizada y de alto rendimiento de parámetros ópticos específicos célula por célula. Para analizar tejidos sólidos , primero se debe preparar una suspensión de células individuales. [ 11 ]

Un citómetro de flujo tiene cinco componentes principales: una celda de flujo, un sistema de medición, un detector, un sistema de amplificación y una computadora para el análisis de las señales. La celda de flujo tiene una corriente líquida (fluido de envoltura) que transporta y alinea las células para que pasen en fila india a través del haz de luz para su detección. El sistema de medición suele utilizar la medición de impedancia (o conductividad) y sistemas ópticos: lámparas ( mercurio , xenón ); láseres de alta potencia refrigerados por agua ( argón , criptón , láser de colorante); láseres de baja potencia refrigerados por aire (argón (488  nm), HeNe rojo (633  nm), HeNe verde, HeCd (UV)); láseres de diodo (azul, verde, rojo, violeta) que generan señales de luz. El detector y el sistema de conversión analógico-digital (ADC) convierten las mediciones analógicas de luz dispersada frontalmente (FSC) y luz dispersada lateralmente (SSC), así como las señales de fluorescencia específicas del colorante, en señales digitales que pueden ser procesadas por una computadora. El sistema de amplificación puede ser lineal o logarítmico .

El proceso de recopilación de datos de muestras mediante el citómetro de flujo se denomina "adquisición". La adquisición se realiza mediante un ordenador conectado físicamente al citómetro de flujo y el software que gestiona la interfaz digital con el mismo. El software permite ajustar parámetros (por ejemplo, voltaje, compensación) para la muestra analizada y, además, ayuda a visualizar la información inicial de la muestra durante la adquisición de datos para garantizar que los parámetros estén configurados correctamente. Los primeros citómetros de flujo eran, en general, dispositivos experimentales, pero los avances tecnológicos han permitido su amplia aplicación en diversos ámbitos clínicos y de investigación. Gracias a estos avances, se ha desarrollado un mercado considerable para la instrumentación, el software de análisis y los reactivos utilizados en la adquisición, como los anticuerpos marcados con fluorescencia .

Los instrumentos modernos suelen contar con múltiples láseres y detectores de fluorescencia. El récord actual para un instrumento comercial es de diez láseres [ 12 ] y 30 detectores de fluorescencia [ 13 ] . El aumento en el número de láseres y detectores permite el marcaje con múltiples anticuerpos y una identificación más precisa de la población objetivo mediante sus marcadores fenotípicos . Algunos instrumentos incluso pueden tomar imágenes digitales de células individuales, lo que permite analizar la ubicación de la señal fluorescente dentro o en la superficie celular.

Hardware

Sistema de fluidos de un citómetro de flujo

Las células deben pasar uniformemente por el centro de los haces láser enfocados para medir con precisión las propiedades ópticas de las células en cualquier citómetro de flujo. [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] El propósito del sistema de fluidos es mover las células una por una a través del haz láser y por todo el instrumento. Los sistemas de fluidos en un citómetro de flujo con capacidad de clasificación celular también utilizan el flujo para transportar las células clasificadas a tubos o pocillos de recolección. [ 14 ]

Enfoque hidrodinámico

Para el posicionamiento preciso de las células en un chorro líquido, se utiliza el enfoque hidrodinámico en la mayoría de los citómetros. [ 14 ] [ 15 ] Las células en suspensión ingresan al instrumento rodeadas por un fluido de envoltura externo. El núcleo de la muestra se mantiene en el centro del fluido de envoltura. La velocidad de entrada de la muestra, o la velocidad a la que las células fluyen hacia la interrogación láser, se puede controlar mediante la presión del fluido de envoltura sobre el núcleo de la muestra. En condiciones óptimas, el flujo central del fluido y el fluido de envoltura no se mezclan.

Enfoque hidrodinámico asistido por acústica

La tecnología de enfoque acústico se utiliza en algunos citómetros de flujo para complementar el enfoque hidrodinámico. [ 14 ] [ 16 ] Las ondas acústicas (>2  MHz) preenfocan la muestra antes de introducirla en el fluido de envoltura. La muestra preenfocada se inyecta en el núcleo hidrodinámico y fluye a través del instrumento. Esto puede contribuir a aumentar la precisión de los datos con altas tasas de entrada de muestras.

Óptica y electrónica

Filtros ópticos

La luz emitida por los fluoróforos se encuentra en un espectro de longitudes de onda, por lo que la combinación de múltiples fluoróforos puede causar superposición. Para aumentar la especificidad, se utilizan filtros ópticos y espejos dicroicos para filtrar y dirigir la luz hacia los detectores, como los tubos fotomultiplicadores (PMT) o los fotodiodos de avalancha (APD). [ 14 ] Los filtros ópticos se diseñan como filtros de paso de banda (BP), de paso largo (LP) o de paso corto (SP). La mayoría de los citómetros de flujo utilizan espejos dicroicos y filtros de paso de banda para seleccionar bandas específicas del espectro óptico.

Prismas, rejillas y citometría de flujo espectral

La citometría de flujo espectral utiliza prismas o rejillas de difracción para dispersar la luz emitida por un marcador a través de una matriz de detectores. [ 14 ] [ 17 ] Esto permite medir el espectro completo de cada partícula. Los espectros medidos de células individuales se descomponen posteriormente utilizando espectros de referencia de todos los colorantes empleados y el espectro de autofluorescencia. Esto puede permitir un diseño de panel más amplio y la aplicación de nuevos marcadores biológicos.

citometría de flujo por imágenes

La citometría de flujo de imágenes (IFC) captura imágenes multicanal de células. [ 14 ] [ 18 ] Los detectores utilizados en las plataformas de imágenes pueden estar equipados con un dispositivo de carga acoplada (CCD) o un semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) para capturar imágenes de células individuales.

Análisis de datos

Compensación

Cada fluorocromo tiene un amplio espectro de fluorescencia. Cuando se utiliza más de un fluorocromo, puede producirse una superposición entre ellos. Esta situación se denomina superposición espectral y debe corregirse. Por ejemplo, el espectro de emisión de FITC y PE es aquel en el que la luz emitida por la fluoresceína se superpone a la misma longitud de onda al pasar a través del filtro utilizado para PE. Esta superposición espectral se corrige eliminando una porción de la señal de FITC de las señales de PE o viceversa. Este proceso se denomina compensación de color, que calcula la intensidad de un fluorocromo como un porcentaje para medirse a sí mismo. [ 19 ]

La compensación es el proceso matemático mediante el cual se corrige la superposición espectral de datos de citometría de flujo multiparamétrica. Dado que los fluorocromos pueden tener un espectro amplio, pueden superponerse, lo que provoca confusión durante el análisis de datos. Esta superposición, conocida como derrame espectral y cuantificada mediante el coeficiente de derrame espectral, suele deberse a que los detectores de un fluorocromo determinado miden un pico significativo en la longitud de onda de otro fluorocromo. El álgebra lineal se utiliza con mayor frecuencia para realizar esta corrección. [ 19 ]

En general, cuando se muestran gráficos de uno o más parámetros, se indica que los demás parámetros no contribuyen a la distribución mostrada. Este problema se agrava especialmente al utilizar parámetros que son más del doble. Actualmente, no se han encontrado herramientas para visualizar de forma eficiente parámetros multidimensionales. La compensación es fundamental para distinguir entre las celdas.

Análisis de una muestra marina de picoplancton fotosintético mediante citometría de flujo que muestra tres poblaciones diferentes ( Prochlorococcus , Synechococcus y picoeucariotas ).

Compuertas

La citometría de flujo clasificó las células sanguíneas en las principales categorías según la dispersión lateral y la expresión de CD45 , en un caso con distribuciones normales.

Los datos generados por los citómetros de flujo se pueden representar en una dimensión para producir un histograma , en diagramas de puntos bidimensionales o incluso en tres dimensiones. Las regiones en estos diagramas se pueden separar secuencialmente, según la intensidad de fluorescencia , mediante la creación de una serie de extracciones de subconjuntos, denominadas "compuertas". Existen protocolos de compuertas específicos para fines diagnósticos y clínicos, especialmente en relación con la hematología . Las células individuales a menudo se distinguen de los dobletes celulares o agregados mayores por su "tiempo de vuelo" (también denominado "ancho de pulso") a través del haz láser enfocado [ 20 ].

Las gráficas suelen representarse en escalas logarítmicas. Debido a la superposición de los espectros de emisión de diferentes colorantes fluorescentes, [ 21 ] [ 22 ] las señales en los detectores deben compensarse tanto electrónica como computacionalmente. Los datos recopilados mediante el citómetro de flujo pueden analizarse con software. Una vez recopilados los datos, no es necesario permanecer conectado al citómetro de flujo y el análisis se realiza generalmente en un ordenador independiente. Esto es especialmente necesario en laboratorios centrales donde el uso de estos equipos es muy frecuente.

Análisis computacional

Los avances recientes en la identificación automatizada de poblaciones mediante métodos computacionales han ofrecido una alternativa a las estrategias de selección tradicionales. Los sistemas de identificación automatizada podrían ayudar a encontrar poblaciones raras y ocultas. Algunos métodos automatizados representativos incluyen FLOCK [ 23 ] en Immunology Database and Analysis Portal (ImmPort), [ 24 ] SamSPECTRAL [ 25 ] y flowClust [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ] en Bioconductor , y FLAME [ 29 ] en GenePattern . T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (tSNE) es un algoritmo diseñado para realizar la reducción de dimensionalidad , para permitir la visualización de datos multidimensionales complejos en un "mapa" bidimensional. [ 30 ] Los esfuerzos de colaboración han dado como resultado un proyecto abierto llamado FlowCAP (Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods, [ 31 ] ) para proporcionar una forma objetiva de comparar y evaluar los métodos de agrupamiento de datos de citometría de flujo, y también para establecer pautas sobre el uso y la aplicación apropiados de estos métodos.

Controles FMO

Los controles de fluorescencia menos uno (FMO) son importantes para la interpretación de datos al crear paneles multicolor, en los que una célula se tiñe simultáneamente con varios fluorocromos. Los controles FMO proporcionan una medida de la interferencia de fluorescencia en un canal determinado y permiten la compensación. Para generar un control FMO, se tiñe una muestra con todos los fluorocromos excepto el que se está probando; es decir, si se utilizan 4 fluorocromos diferentes, el control FMO debe contener solo 3 de ellos (ejemplo: fluorocromos A, B, C, D; FMO: ABC_, AB_D, A_CD, _BCD).

Clasificación celular mediante citometría de flujo

La clasificación celular es un método para purificar poblaciones celulares en función de la presencia o ausencia de características físicas específicas. [ 14 ] [ 16 ] [ 32 ] En los citómetros de flujo con capacidad de clasificación, el instrumento detecta las células utilizando parámetros como el tamaño celular, la morfología y la expresión de proteínas, y luego emplea tecnología de gotas para clasificar las células y recuperar los subconjuntos para su uso posterior al experimento. [ 14 ] [ 16 ]

El primer prototipo de clasificador fue construido en el Laboratorio Nacional de Los Alamos (LANL) en 1965 por el físico Mack J. Fulwyler, mediante la unión de un sensor de volumen Coulter con la impresora de inyección de tinta de reciente invención. [ 33 ] El clasificador de células vivas o clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) [ a ] ​​fue creado por Len Herzenberg , quien posteriormente ganó el Premio Kioto en 2006 por su trabajo fundamental. [ 35 ]

Clasificación celular mediante citometría de flujo y tecnología de microgotas.

Los clasificadores de células por citometría de flujo tienen un sistema de recolección distinto al de los analizadores de citometría de flujo. El proceso de recolección comienza cuando se inyecta una muestra en un flujo de fluido de envoltura que pasa a través de la celda de flujo y es interceptado por un láser. [ 36 ]  El flujo transporta la célula a través de una boquilla vibratoria que genera gotitas, la mayoría de las cuales contienen una sola célula o ninguna. Se coloca un anillo de carga eléctrica justo en el punto donde el flujo se divide en gotitas y se aplica una carga al anillo inmediatamente antes de medir la intensidad de fluorescencia; la carga opuesta queda atrapada en la gotita al separarse del flujo, por lo que las gotitas quedan cargadas. Las gotitas cargadas caen a través de un sistema de deflexión electrostática que las desvía a contenedores según su carga. En algunos sistemas, la carga se aplica directamente al flujo, y la gotita que se separa conserva una carga del mismo signo que el flujo. El flujo vuelve a ser neutro después de que la gotita se separa. Después de la recolección, estas células pueden cultivarse, manipularse y estudiarse.

Etiquetas

Uso de la citometría de flujo para medir la variación del número de copias de una secuencia de ADN específica ( Flow-FISH ).

La citometría de flujo utiliza las propiedades de la luz dispersada por células o partículas para la identificación o la medición cuantitativa de propiedades físicas. Se pueden utilizar marcadores, colorantes y tinciones para el análisis multiparamétrico (que permite comprender mejor las propiedades de una célula). El inmunofenotipado consiste en el análisis de poblaciones heterogéneas de células mediante anticuerpos marcados [ 37 ] y otros reactivos que contienen fluoróforos, como colorantes y tinciones.

Etiquetas fluorescentes

Una amplia gama de fluoróforos puede utilizarse como marcadores en citometría de flujo. [ 21 ] Los fluoróforos, o simplemente "fluores", suelen estar unidos a un anticuerpo que reconoce una característica diana en la célula o en su interior; también pueden estar unidos a una entidad química con afinidad por la membrana celular u otra estructura celular. Cada fluoróforo tiene una longitud de onda de excitación y emisión máxima característica , y los espectros de emisión a menudo se superponen. En consecuencia, la combinación de marcadores que se puede utilizar depende de la longitud de onda de la(s) lámpara(s) o láser(es) utilizados para excitar los fluorocromos y de los detectores disponibles. [ 38 ] La citometría de flujo utiliza la fluorescencia como herramienta cuantitativa; la máxima sensibilidad de la citometría de flujo no tiene parangón con otras plataformas de detección de fluorescencia como la microscopía confocal . La sensibilidad absoluta de la fluorescencia es generalmente menor en la microscopía confocal porque las señales desenfocadas son rechazadas por el sistema óptico confocal y porque la imagen se construye en serie a partir de mediciones individuales en cada ubicación de la célula, lo que reduce la cantidad de tiempo disponible para recoger la señal. [ 39 ]

Puntos cuánticos

En ocasiones, los puntos cuánticos se utilizan en lugar de los fluoróforos tradicionales debido a que sus picos de emisión son más estrechos.

Marcaje isotópico

La citometría de masas supera la limitación del marcaje fluorescente mediante el uso de isótopos de lantánidos unidos a anticuerpos. Este método podría permitir teóricamente el uso de entre 40 y 60 marcadores distinguibles y se ha demostrado para 30 marcadores. [ 40 ] La citometría de masas es fundamentalmente diferente de la citometría de flujo: las células se introducen en un plasma , se ionizan y los isótopos asociados se cuantifican mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo . Aunque este método permite el uso de un gran número de marcadores, actualmente tiene una capacidad de procesamiento menor que la citometría de flujo. También destruye las células analizadas, lo que impide su recuperación mediante clasificación. [ 40 ]

Matriz de microesferas citométricas

Además de la capacidad de marcar e identificar células individuales mediante anticuerpos fluorescentes, también se pueden medir productos celulares como citocinas, proteínas y otros factores. De forma similar a los ensayos ELISA tipo sándwich, los ensayos de matriz de microesferas citométricas ( CBA ) utilizan múltiples poblaciones de microesferas, generalmente diferenciadas por tamaño y distintos niveles de intensidad de fluorescencia, para distinguir múltiples analitos en un solo ensayo. La cantidad del analito capturado se detecta mediante un anticuerpo biotinilado contra un epítopo secundario de la proteína, seguido de un tratamiento con estreptavidina-R-ficoeritrina. La intensidad de fluorescencia de la R-ficoeritrina en las microesferas se cuantifica en un citómetro de flujo equipado con una  fuente de excitación de 488 nm. Las concentraciones de una proteína de interés en las muestras se pueden obtener comparando las señales fluorescentes con las de una curva estándar generada a partir de una dilución en serie de una concentración conocida del analito. También se conoce comúnmente como matriz de microesferas de citocinas (CBA).

citometría de flujo de impedancia

Los sistemas de análisis de células individuales basados ​​en impedancia se conocen comúnmente como contadores Coulter . Representan un método bien establecido para contar y medir prácticamente cualquier tipo de células y partículas. La tecnología sin marcadores se ha mejorado recientemente mediante un enfoque basado en " laboratorio en un chip " y mediante la aplicación de corriente alterna (CA) de alta frecuencia en el rango de radiofrecuencia (de 100  kHz a 30  MHz) en lugar de una corriente continua (CC) estática o un campo de CA de baja frecuencia. [ 41 ] [ 42 ] Esta tecnología patentada permite un análisis celular de alta precisión y proporciona información adicional como la capacitancia de la membrana y la viabilidad . Su tamaño relativamente pequeño y su robustez permiten su uso in situ con alimentación por batería.

Parámetros medibles

En el análisis celular y la citometría de flujo, los factores medibles incluyen un conjunto diverso de características e indicadores que proporcionan información importante sobre la biología y la función celular. Las técnicas de citometría de flujo permiten cuantificar y evaluar estos factores, lo que posibilita a los investigadores estudiar y analizar diversos aspectos de las células. A continuación, se presentan algunos parámetros cuantificables importantes que se investigan con frecuencia:

  • Apoptosis: La apoptosis se puede cuantificar mediante citometría de flujo midiendo la destrucción del ADN, el potencial de membrana mitocondrial, las alteraciones de la permeabilidad y la actividad de las caspasas. Estas mediciones revelan detalles importantes sobre la muerte celular programada.
  • Adherencia celular: La citometría de flujo puede utilizarse para investigar la adhesión celular, como la adhesión entre células patógenas y células huésped. Los investigadores pueden cuantificar y analizar los eventos de adhesión celular mediante el uso de marcadores específicos o etiquetas fluorescentes.
  • Pigmentos celulares: La clorofila y la ficoeritrina son pigmentos presentes en ciertas células. La presencia y la cantidad de estos pigmentos se pueden medir mediante citometría de flujo, lo que proporciona información sobre el metabolismo celular y los estados fisiológicos.
  • Antígenos de la superficie celular: La citometría de flujo se utiliza frecuentemente para identificar y cuantificar antígenos de la superficie celular, también conocidos como marcadores de diferenciación celular (CD). Los investigadores pueden clasificar poblaciones celulares según la expresión de antígenos de superficie mediante el marcaje de las células con anticuerpos específicos.
La citometría de flujo con 7-aminoactinomicina D (7-AAD) muestra que una señal más baja indica células viables. Por lo tanto, este caso presenta una buena viabilidad.
  • Viabilidad celular: La citometría de flujo puede utilizarse como ensayo de viabilidad celular mediante el uso de colorantes o marcadores fluorescentes que distinguen entre células vivas y muertas. Este parámetro es fundamental para determinar la salud celular y la respuesta a entornos experimentales o terapéuticos. La viabilidad de las células en la citometría de flujo debe rondar el 95 %, pero no ser inferior al 90 %. [ 43 ]
  • Células tumorales circulantes: La citometría de flujo es fundamental para aislar y purificar las células tumorales circulantes (CTC) a partir de muestras de sangre. Las CTC pueden detectarse y analizarse mediante la identificación de marcadores o características específicas, lo que facilita el diagnóstico, el pronóstico y el seguimiento del tratamiento del cáncer.
  • Caracterización de la resistencia a múltiples fármacos (MDR): La citometría de flujo permite caracterizar la resistencia a múltiples fármacos (MDR) en células cancerosas mediante la evaluación de la salida de colorantes fluorescentes o marcadores específicos asociados a los mecanismos de resistencia a los fármacos. Este conocimiento contribuye a la comprensión y el tratamiento de la resistencia a los medicamentos en el tratamiento del cáncer.
  • Análisis y clasificación de cromosomas: La citometría de flujo puede ayudar con el análisis y la clasificación de cromosomas, lo que permite la creación de bibliotecas y la identificación de cromosomas específicos o anomalías cromosómicas.
  • Variación del número de copias de ADN: Esta variación se puede medir mediante técnicas de citometría de flujo, como Flow-FISH o la tecnología BACs-on-Beads. Estas tecnologías permiten comprender mejor los cambios genéticos relacionados con enfermedades como el cáncer.
  • Expresión y modificaciones de proteínas: Mediante anticuerpos o sondas marcadas con fluorescencia, la citometría de flujo permite evaluar los niveles de expresión de proteínas y alteraciones como la fosforilación. Este parámetro contribuye a una mejor comprensión de la función de las proteínas y las redes de señalización.
  • Fluidez de la membrana: La citometría de flujo permite detectar la fluidez de la membrana mediante sondas fluorescentes sensibles a sus características. Este parámetro proporciona información sobre la dinámica y la función de las membranas celulares.
  • Contenido total de ADN y ARN: La citometría de flujo permite medir el contenido total de ADN y ARN en las células. Estos datos son útiles para el análisis del ciclo celular, la investigación de la proliferación y la determinación de los cambios en la expresión génica.
  • Monitorización de parámetros intracelulares: Mediante citometría de flujo se pueden medir factores intracelulares como el pH, los niveles intracelulares de calcio y magnesio ionizados, el potencial de membrana, los niveles de glutatión y el estallido oxidativo. Estos datos proporcionan información sobre el metabolismo celular, la señalización y el estrés oxidativo .
  • Dispersión de la luz: En citometría de flujo, se utilizan las mediciones de dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) para evaluar el volumen celular y la complejidad morfológica, respectivamente. Estas métricas describen el tamaño, la granularidad y la forma de las células.
  • Productos transgénicos: La citometría de flujo es útil para evaluar productos transgénicos in vivo, en particular proteínas fluorescentes como la proteína verde fluorescente (GFP) o variantes similares. Esto permite a los científicos investigar la expresión génica, la localización de proteínas y la dinámica celular.
  • Varias combinaciones: La citometría de flujo permite integrar muchos datos medibles, como ADN/antígenos de superficie, para obtener una comprensión integral de las características y funciones biológicas. [ 44 ]

Aplicaciones

La tecnología tiene aplicaciones en varios campos, incluyendo biología molecular , patología , inmunología , virología, [ 45 ] biología vegetal y biología marina . [ 46 ] Tiene una amplia aplicación en medicina especialmente en trasplantes, hematología, inmunología tumoral y quimioterapia, diagnóstico prenatal, genética y clasificación de espermatozoides para preselección de sexo . La citometría de flujo se aplica ampliamente para detectar anomalías en las células espermáticas asociadas con la fragmentación del ADN [ 47 ] en ensayos de fertilidad masculina . [ 48 ] También se utiliza extensamente en investigación para la detección de daño en el ADN , [ 49 ] [ 50 ] escisión de caspasa y apoptosis . [ 51 ] La citometría de flujo fotoacústica se utiliza en el estudio de bacterias multirresistentes (más comúnmente SARM) para detectar, diferenciar y cuantificar bacterias en la sangre marcadas con bacteriófagos teñidos. [ 52 ] En neurociencia , también se puede analizar la coexpresión de antígenos de superficie celular e intracelulares. [ 53 ] En microbiología, se puede utilizar para examinar y clasificar bibliotecas de mutantes de transposones construidas con un transposón que codifica GFP (TnMHA), [ 54 ] o para evaluar la viabilidad. [ 55 ] En ingeniería de proteínas, la citometría de flujo se utiliza junto con la presentación en levaduras y la presentación bacteriana para identificar variantes de proteínas presentadas en la superficie celular con las propiedades deseadas. Las principales ventajas de la citometría de flujo sobre la histología y la IHC son la posibilidad de medir con precisión las cantidades de antígenos y la posibilidad de teñir cada célula con múltiples anticuerpos-fluoróforos; en los laboratorios actuales, se pueden unir alrededor de 10 anticuerpos a cada célula. Esto es mucho menos que el citómetro de masas, donde actualmente se pueden medir hasta 40, pero a un precio más alto y a un ritmo más lento.

Investigación acuática

En los sistemas acuáticos, la citometría de flujo se utiliza para el análisis de células autofluorescentes o células marcadas con fluorescencia mediante tinciones añadidas. Esta investigación comenzó en 1981 cuando Clarice Yentsch utilizó la citometría de flujo para medir la fluorescencia en un dinoflagelado productor de marea roja. [ 56 ] Al año siguiente, los investigadores publicaron mediciones de citometría de flujo de múltiples especies de algas que podían distinguirse en función de sus características de fluorescencia. [ 57 ] Para 1983, los investigadores marinos estaban ensamblando sus propios citómetros de flujo [ 58 ] o utilizando citómetros de flujo disponibles comercialmente en muestras de agua de mar recolectadas en las costas de las Bermudas para demostrar que las células de fitoplancton podían distinguirse del material no vivo y que las cianobacterias podían separarse de una comunidad mixta y posteriormente cultivarse en el laboratorio. [ 59 ] La citometría de flujo también permitió a los investigadores marinos distinguir entre Prochlorococcus de baja fluorescencia y microorganismos heterótrofos, una distinción que es difícil con evaluaciones basadas en microscopía. [ 60 ] Los avances tecnológicos permiten ahora a los científicos acuáticos utilizar citómetros de flujo de forma continua durante las campañas de investigación [ 61 ] y los citómetros de flujo se utilizan para proporcionar imágenes de células individuales de fitoplancton. [ 62 ] [ 63 ] Los científicos marinos utilizan la capacidad de clasificación de los citómetros de flujo para realizar mediciones discretas de la actividad y diversidad celular, [ 64 ] [ 65 ] para llevar a cabo investigaciones sobre las relaciones mutualistas entre microorganismos que viven muy cerca, [ 66 ] y para medir las tasas biogeoquímicas de múltiples procesos en el océano. [ 67 ]

Ensayo de proliferación celular

La proliferación celular es la función principal del sistema inmunitario. A menudo se requiere analizar la naturaleza proliferativa de las células para llegar a ciertas conclusiones. Un ensayo para determinar la proliferación celular es el del colorante de seguimiento éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE). Este ayuda a monitorizar las células proliferativas. Este ensayo proporciona datos tanto cuantitativos como cualitativos durante experimentos de series temporales. [ 68 ] Este colorante se une covalentemente a las moléculas de larga vida presentes en el interior de la célula. Cuando las células se dividen, las moléculas también se dividen y las células hijas poseen la mitad del colorante que la población parental. Esta disminución en la intensidad se puede visualizar mediante citometría de flujo. [ 69 ] En la literatura, esta potente técnica de citometría de flujo y CFSE se ha utilizado para determinar la eficacia de las células T en la eliminación de células diana en cánceres como la leucemia. Para visualizar la muerte de las células diana, tanto rápida como lenta, los científicos han utilizado el marcaje con CFSE con tinción de anticuerpos de ciertos tipos de células y microesferas marcadas con fluorescencia. Esto también proporcionó información sobre la proliferación de las células diana tras el tratamiento con ciertas citocinas. [ 70 ]

Medición del tamaño del genoma

La citometría de flujo se ha utilizado para medir el tamaño del genoma , o más precisamente: la cantidad de ADN en una célula o núcleo . Si bien los genomas pueden analizarse con mayor precisión mediante la secuenciación genómica , esto suele ser difícil debido a la alta proporción de microcromosomas o secuencias repetitivas que pueden pasar desapercibidas durante la secuenciación (o que se filtran durante el análisis cuando no pueden asignarse a cromosomas ). Sin embargo, la citometría de flujo tampoco es perfecta. El tamaño del genoma resultante puede variar según el colorante utilizado. Un análisis de genomas de peces arrojó tamaños genómicos significativamente diferentes al utilizar yoduro de propidio (PI) y DAPI , respectivamente. Por ejemplo, se encontró que el genoma de Anguilla japonica contenía 1,09 pg de ADN con PI frente a 1,25 pg con DAPI. De manera similar, se encontró que el genoma de Myxocyprinus asiaticus contenía 2,75 pg de ADN (PI) frente a 3,08 pg (DAPI). Es decir, las diferencias fueron del orden del 12-14%. [ 71 ]

Véase también

Notas

  1. ↑ El acrónimo FACS es una marca registrada propiedad de BD Biosciences-Immunocytometry Systems, una división de Becton-Dickinson, que obtuvo la licencia de las patentes de Stanford. [ 32 ] [ 34 ]

Referencias

  1. ↑ Picot J, Guerin CL, Le Van Kim C, Boulanger CM (marzo de 2012). "Citometría de flujo: retrospectiva, fundamentos e instrumentación reciente" . Cytotechnology . 64 ( 2): 109–30 . doi : 10.1007/s10616-011-9415-0 . PMC 3279584. PMID 22271369 .  
  2. ↑ "citometría de flujo" . TheFreeDictionary.com . Consultado el 18 de septiembre de 2018 .
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