Microfluorimetría

La microfluorimetría es una adaptación de la fluorimetría para estudiar las propiedades bioquímicas y biofísicas de las células mediante el uso de la microscopía para obtener imágenes de componentes celulares marcados con moléculas fluorescentes . Es un tipo de microfotometría que proporciona una medida cuantitativa de la naturaleza cualitativa de la medición de fluorescencia y, por lo tanto, permite obtener resultados definitivos que antes habrían sido imperceptibles a simple vista. ^{[ 1 ]}

La microfluorimetría tiene aplicaciones en diversos campos, como la biología celular , la microbiología , la inmunología , el análisis del ciclo celular y el cariotipado por flujo de células. ^{[ 2 ]} En el cariotipado por flujo, los cromosomas metafásicos aislados se tiñen y miden en un microfluorómetro de flujo. La tinción fluorescente de los cromosomas también permite determinar la distribución de la frecuencia relativa de aparición y el contenido de ADN cromosómico de los cromosomas medidos. Esta técnica permite realizar cariotipados a mayor velocidad que con métodos anteriores y se ha demostrado su precisión utilizando cromosomas de hámster chino. ^{[ 3 ]} La microfluorimetría de flujo (FMF) también se puede utilizar para determinar diferentes poblaciones de células mediante marcadores fluorescentes con pequeñas muestras celulares. Los marcadores utilizados para la medición en la microfluorimetría de flujo están compuestos por antígenos fluorescentes o agentes de unión al ADN. ^{[ 2 ]} Permite la medición precisa de un anticuerpo que reacciona con un antígeno . ^{[ 1 ]} La microfluorimetría de flujo también se utiliza en la investigación farmacéutica para determinar el tipo de célula, la expresión de proteínas y ADN, el ciclo celular y otras propiedades de una célula durante el tratamiento farmacológico. ^{[ 4 ]} Por ejemplo, la microfluorimetría se utiliza en neuronas para comparar los efectos de las neurotoxinas tanto en la concentración de iones de calcio como en el potencial de membrana mitocondrial en células individuales. ^{[ 5 ]} La microfluorimetría también puede utilizarse como método para distinguir diferentes microorganismos entre sí mediante el análisis y la comparación del contenido de ADN de cada célula. ^{[ 6 ]} Este mismo concepto también puede aplicarse para distinguir entre tipos de células utilizando un colorante fluorescente adecuado que varía según el propósito y es una técnica crítica en la biología celular y la genómica modernas. ^{[ 7 ]}

Otro uso de la microfluorometría es la citometría de flujo , que utiliza la emisión de moléculas de fluorocromo y, generalmente, un láser como fuente de luz para generar datos a partir de partículas y células. ^{[ 8 ]} Se puede utilizar para separar cromosomas a una velocidad muy alta y se integra fácilmente con la secuenciación de nueva generación. Esta técnica permite separar únicamente los cromosomas relevantes a una velocidad muy rápida. ^{[ 9 ]} Por ejemplo, los bacteriófagos lambda y T4 de E. coli pudieron separarse mediante citometría de flujo, lo que posibilitó un análisis genómico que antes resultaba difícil. ^{[ 10 ]}

La microfluorimetría se basa en el método establecido de medición fluorimétrica. Mediante un colorante que fluoresce en presencia de un compuesto objetivo, la fluorimetría puede detectar la presencia de dicho compuesto determinando la presencia e intensidad de la fluorescencia. Las diferencias en la intensidad permiten determinar la concentración del compuesto. Además, si el colorante experimenta un desplazamiento espectral, se puede determinar la concentración absoluta del objetivo independientemente de la concentración del colorante. Fura-2 es un ejemplo de colorante fluorescente utilizado para medir el calcio. La microfluorimetría amplía la fluorimetría al incorporar un componente microscópico a las mediciones, lo que permite el análisis de células individuales y otros objetos de interés microscópico. ^{[ 11 ]}

Un microfluorómetro es un espectrofotómetro de fluorescencia combinado con un microscopio, diseñado para medir espectros de fluorescencia de muestras o áreas microscópicas, o puede configurarse para medir los espectros de transmisión y reflectancia de áreas de muestras microscópicas. Puede ser un microfluorómetro completo construido exclusivamente para microespectroscopia de fluorescencia o la unidad de espectrómetro de fluorescencia que se acopla al puerto óptico de un microscopio. ^{[ 12 ]} Un microfluorómetro puede utilizarse para estimar cantidades y distribuciones de componentes químicos en células individuales o en cromosomas. Para estimar la cantidad de componentes químicos, se mide su intensidad de fluorescencia mediante fotometría fotoeléctrica, mientras que la distribución se determina midiendo las intensidades de las fotos de las placas metafásicas de cromosomas negativos. ^{[ 13 ]} Un microespectrofotómetro puede medir espectros de transmisión, absorbancia, reflectancia y emisión; luego, utilizando algoritmos integrados, se produce un espectro que puede compararse con datos previos para determinar la composición, la concentración, etc. ^{[ 12 ]}

Existen muchas fuentes de error en el proceso, pero los errores biológicos, como la incapacidad de preparar muestras homogéneas, tienen más probabilidades de ser una limitación que los errores técnicos. ^{[ 1 ]}

• Espectroscopia de fluorescencia , para una discusión completa sobre la medición de fluorescencia.
• Fluorómetro , para una descripción más completa de los dispositivos para la medición de fluorescencia.

• http://microspectra.com/component/content/article/52-craictech/81-microfluorometer , Microfluorómetro
• https://www.youtube.com/watch?v=_lmkEqTHj3Y , Explicación en vídeo de una aplicación de la microfluorimetría
• http://www5.pbrc.hawaii.edu/bln/ian/imaged_microfluorimetry.html , Una lectura de microfluorimetría