Vector de expresión

Un vector de expresión , también conocido como constructo de expresión , suele ser un plásmido o virus diseñado para la expresión génica en células. El vector se utiliza para introducir un gen específico en una célula diana y puede controlar el mecanismo celular de síntesis de proteínas para producir la proteína codificada por dicho gen. Los vectores de expresión son herramientas fundamentales en biotecnología para la producción de proteínas .

El vector está diseñado para contener secuencias reguladoras que actúan como regiones potenciadoras y promotoras y conducen a la transcripción eficiente del gen transportado en el vector de expresión. ^{[ 1 ]} El objetivo de un vector de expresión bien diseñado es la producción eficiente de proteína, y esto puede lograrse mediante la producción de una cantidad significativa de ARN mensajero estable , que luego puede traducirse en proteína. La expresión de una proteína puede controlarse estrictamente, y la proteína solo se produce en cantidad significativa cuando es necesario mediante el uso de un inductor . En algunos sistemas, sin embargo, la proteína puede expresarse constitutivamente. Escherichia coli se usa comúnmente como huésped para la producción de proteínas , pero también se pueden usar otros tipos de células. Un ejemplo del uso de un vector de expresión es la producción de insulina , que se usa para tratamientos médicos de la diabetes .

Un vector de expresión posee características comunes a cualquier vector , como un origen de replicación , un marcador seleccionable y un sitio adecuado para la inserción de un gen, como el sitio de clonación múltiple . El gen clonado puede transferirse de un vector de clonación especializado a un vector de expresión, aunque también es posible clonarlo directamente en este último. El proceso de clonación se realiza normalmente en Escherichia coli . Los vectores utilizados para la producción de proteínas en organismos distintos de E. coli pueden tener, además de un origen de replicación adecuado para su propagación en E. coli , elementos que permiten su mantenimiento en otro organismo; estos vectores se denominan vectores lanzadera .

Un vector de expresión debe tener los elementos necesarios para la expresión génica. Estos pueden incluir un promotor , la secuencia de iniciación de la traducción correcta, como un sitio de unión ribosomal y un codón de inicio , un codón de terminación y una secuencia de terminación de la transcripción . ^{[ 2 ]} Hay diferencias en la maquinaria para la síntesis de proteínas entre procariotas y eucariotas, por lo tanto, los vectores de expresión deben tener los elementos de expresión que sean apropiados para el huésped elegido. Por ejemplo, los vectores de expresión de procariotas tendrían una secuencia Shine-Dalgarno en su sitio de iniciación de la traducción para la unión de los ribosomas, mientras que los vectores de expresión de eucariotas contendrían la secuencia consenso de Kozak .

El promotor inicia la transcripción y, por lo tanto, es el punto de control para la expresión del gen clonado. Los promotores utilizados en los vectores de expresión suelen ser inducibles , lo que significa que la síntesis de proteínas solo se inicia cuando se requiere mediante la introducción de un inductor como el IPTG . Sin embargo, la expresión génica también puede ser constitutiva (es decir, la proteína se expresa constantemente) en algunos vectores de expresión. Incluso en vectores de expresión con promotores estrictamente controlados, puede producirse un bajo nivel de síntesis proteica constitutiva.

Tras la expresión del producto génico, puede ser necesario purificar la proteína expresada; sin embargo, separar la proteína de interés de la gran mayoría de las proteínas de la célula huésped puede ser un proceso prolongado. Para facilitar este proceso de purificación, se puede añadir una etiqueta de purificación al gen clonado. Esta etiqueta podría ser una etiqueta de histidina (His) , otros péptidos marcadores o socios de fusión como la glutatión S-transferasa o la proteína de unión a maltosa . ^{[ 3 ]} Algunos de estos socios de fusión también pueden ayudar a aumentar la solubilidad de algunas proteínas expresadas. Otras proteínas de fusión, como la proteína verde fluorescente, pueden actuar como gen reportero para la identificación de genes clonados con éxito, o pueden utilizarse para estudiar la expresión de proteínas en imágenes celulares . ^{[ 4 ] [ 5 ]}

El vector de expresión se transforma o transfecta en la célula huésped para la síntesis de proteínas. Algunos vectores de expresión pueden contener elementos para la transformación o la inserción de ADN en el cromosoma del huésped; por ejemplo, los genes vir para la transformación de plantas y los sitios de integrasa para la integración cromosómica.

Algunos vectores pueden incluir una secuencia de direccionamiento que permite dirigir la proteína expresada a una ubicación específica, como el espacio periplásmico de las bacterias.

Se pueden utilizar diferentes organismos para expresar la proteína diana de un gen, por lo que el vector de expresión empleado contendrá elementos específicos para dicho organismo. El organismo más utilizado para la producción de proteínas es la bacteria Escherichia coli . Sin embargo, no todas las proteínas pueden expresarse con éxito en E. coli , ni con las modificaciones postraduccionales correctas, como las glicosilaciones; por consiguiente, pueden utilizarse otros sistemas.

El huésped de expresión preferido para la expresión de muchas proteínas es Escherichia coli , ya que la producción de proteínas heterólogas en E. coli es relativamente sencilla y práctica, además de rápida y económica. También se dispone de una gran cantidad de plásmidos de expresión de E. coli para una amplia variedad de necesidades. Otras bacterias utilizadas para la producción de proteínas incluyen Bacillus subtilis .

La mayoría de las proteínas heterólogas se expresan en el citoplasma de E. coli . Sin embargo, no todas las proteínas formadas son solubles en el citoplasma, y ​​las proteínas mal plegadas que se forman en el citoplasma pueden formar agregados insolubles llamados cuerpos de inclusión . Estas proteínas insolubles requieren replegamiento, un proceso que puede ser complejo y que no necesariamente produce un alto rendimiento. ^{[ 6 ]} Las proteínas que tienen enlaces disulfuro a menudo no pueden plegarse correctamente debido al ambiente reductor del citoplasma, que impide la formación de dichos enlaces, y una posible solución es dirigir la proteína al espacio periplásmico mediante el uso de una secuencia señal N-terminal . Otra posibilidad es manipular el ambiente redox del citoplasma. ^{[ 7 ]} También se están desarrollando otros sistemas más sofisticados; estos sistemas podrían permitir la expresión de proteínas que antes se consideraban imposibles en E. coli , como las proteínas glicosiladas . ^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]}

Los promotores utilizados para estos vectores suelen basarse en el promotor del operón lac o en el promotor T7 , ^{[ 11 ]} y normalmente están regulados por el operador lac . Estos promotores también pueden ser híbridos de diferentes promotores; por ejemplo, el promotor Tac es un híbrido de los promotores trp y lac . ^{[ 12 ]} Cabe destacar que la mayoría de los promotores lac o derivados de lac utilizados se basan en el mutante lac UV5 , que es insensible a la represión catabólica . Este mutante permite la expresión de proteínas bajo el control del promotor lac cuando el medio de cultivo contiene glucosa, ya que la glucosa inhibiría la expresión génica si se utilizara el promotor lac de tipo silvestre . ^{[ 13 ]} No obstante, la presencia de glucosa puede utilizarse para reducir la expresión basal mediante inhibición residual en algunos sistemas. ^{[ 14 ]}

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli son la serie de vectores pGEX, donde se utiliza la glutatión S-transferasa como socio de fusión y la expresión génica está bajo el control del promotor tac, ^{[ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]} y la serie de vectores pET, que utiliza un promotor T7 . ^{[ 18 ]}

Es posible expresar simultáneamente dos o más proteínas diferentes en E. coli utilizando distintos plásmidos. Sin embargo, cuando se utilizan dos o más plásmidos, cada uno requiere una selección de antibióticos diferente, así como un origen de replicación distinto; de lo contrario, uno de los plásmidos podría no mantenerse estable. Muchos plásmidos de uso común se basan en el replicón ColE1 y, por lo tanto, son incompatibles entre sí. Para que un plásmido basado en ColE1 coexista con otro en la misma célula, este último debería ser de un replicón diferente, por ejemplo, un plásmido basado en el replicón p15A, como la serie de plásmidos pACYC. ^{[ 19 ]} Otro enfoque sería utilizar un único vector de dos cistrones o diseñar las secuencias codificantes en tándem como una construcción bi- o policistrónica. ^{[ 20 ] [ 21 ]}

Una levadura comúnmente utilizada para la producción de proteínas es Pichia pastoris . ^{[ 22 ]} Ejemplos de vectores de expresión de levadura en Pichia son los vectores de la serie pPIC, que utilizan el promotor AOX1 , inducible con metanol . ^{[ 23 ]} Los plásmidos pueden contener elementos para la inserción de ADN extraño en el genoma de la levadura y una secuencia señal para la secreción de la proteína expresada. Las proteínas con enlaces disulfuro y glicosilación pueden producirse eficientemente en levadura. Otra levadura utilizada para la producción de proteínas es Kluyveromyces lactis , cuyo gen se expresa impulsado por una variante del potente promotor de lactasa LAC4. ^{[ 24 ]}

Saccharomyces cerevisiae se utiliza ampliamente para estudios de expresión génica en levaduras, por ejemplo, en el sistema de doble híbrido de levadura para el estudio de la interacción proteína-proteína. ^{[ 25 ]} Los vectores utilizados en el sistema de doble híbrido de levadura contienen socios de fusión para dos genes clonados que permiten la transcripción de un gen reportero cuando hay interacción entre las dos proteínas expresadas a partir de los genes clonados.

El baculovirus , un virus con forma de varilla que infecta células de insectos, se utiliza como vector de expresión en este sistema. ^{[ 26 ]} Se utilizan líneas celulares de insectos derivadas de lepidópteros (polillas y mariposas), como Spodoptera frugiperda , como huésped. Una línea celular derivada de la oruga de la col es de particular interés, ya que se ha desarrollado para crecer rápidamente y sin el costoso suero que normalmente se necesita para estimular el crecimiento celular. ^{[ 27 ] [ 28 ]} El vector lanzadera se llama bacmido, y la expresión génica está bajo el control de un promotor fuerte pPolh. ^{[ 29 ]} El baculovirus también se ha utilizado con líneas celulares de mamíferos en el sistema BacMam . ^{[ 30 ]}

El baculovirus se utiliza habitualmente para la producción de glicoproteínas , aunque las glicosilaciones pueden diferir de las que se encuentran en los vertebrados. En general, su uso es más seguro que el de los virus de mamíferos, ya que tiene un rango de hospedadores limitado y no infecta a los vertebrados sin modificaciones.

Muchos vectores de expresión vegetal se basan en el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens . ^{[ 31 ]} En estos vectores de expresión, el ADN que se insertará en la planta se clona en el T-ADN , un segmento de ADN flanqueado por una secuencia de repetición directa de 25 pb en cada extremo, que puede integrarse en el genoma de la planta. El T-ADN también contiene el marcador de selección. Agrobacterium proporciona un mecanismo para la transformación , la integración en el genoma de la planta, y los promotores de sus genes vir también pueden utilizarse para los genes clonados. Sin embargo, la preocupación por la transferencia de material genético bacteriano o viral a la planta ha llevado al desarrollo de vectores llamados vectores intragénicos, en los que se utilizan equivalentes funcionales del genoma de la planta para evitar la transferencia de material genético de una especie extraña a la planta. ^{[ 32 ]}

Los virus vegetales pueden utilizarse como vectores, ya que el método de Agrobacterium no funciona en todas las plantas. Ejemplos de virus vegetales utilizados son el virus del mosaico del tabaco (TMV), el virus X de la patata y el virus del mosaico del caupí . ^{[ 33 ]} La proteína puede expresarse como una fusión a la proteína de la cápside del virus y se muestra en la superficie de las partículas virales ensambladas, o como una proteína no fusionada que se acumula dentro de la planta. La expresión en plantas mediante vectores vegetales suele ser constitutiva, ^{[ 34 ]} y un promotor constitutivo comúnmente utilizado en vectores de expresión vegetal es el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). ^{[ 35 ] [ 36 ]}

Los vectores de expresión de mamíferos ofrecen ventajas considerables para la expresión de proteínas de mamíferos sobre los sistemas de expresión bacteriana: plegamiento adecuado, modificaciones postraduccionales y actividad enzimática relevante. También pueden ser más deseables que otros sistemas eucariotas no mamíferos, donde las proteínas expresadas pueden no contener las glicosilaciones correctas. Son particularmente útiles para producir proteínas asociadas a membranas que requieren chaperonas para un plegamiento y estabilidad adecuados, además de contener numerosas modificaciones postraduccionales. Sin embargo, la desventaja radica en el bajo rendimiento del producto en comparación con los vectores procariotas, así como en el alto costo de las técnicas involucradas. Su tecnología compleja y la posible contaminación con virus animales en la expresión de células de mamíferos también han limitado su uso en la producción industrial a gran escala. ^{[ 37 ]}

Se pueden utilizar líneas celulares de mamíferos cultivadas, como las de ovario de hámster chino (CHO) y COS , incluyendo líneas celulares humanas como HEK y HeLa, para producir proteínas. Los vectores se transfectan en las células y el ADN puede integrarse en el genoma mediante recombinación homóloga en el caso de una transfección estable, o bien las células pueden transfectarse transitoriamente. Ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen los vectores adenovirales , ^{[ 38 ]} las series de plásmidos pSV y pCMV, los vectores vaccinia y retrovirales , ^{[ 39 ]} así como el baculovirus. ^{[ 30 ]} Los promotores del citomegalovirus (CMV) y del SV40 se utilizan comúnmente en vectores de expresión de mamíferos para impulsar la expresión génica. También se conocen promotores no virales, como el promotor del factor de elongación (EF)-1. ^{[ 40 ]}

En este método in vitro de producción de proteínas se utiliza un lisado celular de E. coli que contiene los componentes celulares necesarios para la transcripción y la traducción . La ventaja de este sistema es que la proteína se puede producir mucho más rápido que la producida in vivo, ya que no requiere tiempo de cultivo celular, pero también es más costoso. Se pueden utilizar vectores empleados para la expresión en E. coli, aunque también existen vectores diseñados específicamente para este sistema. Los extractos de células eucariotas también se pueden utilizar en otros sistemas libres de células, por ejemplo, los sistemas de expresión libres de células de germen de trigo . ^{[ 41 ]} También se han producido sistemas libres de células de mamíferos. ^{[ 42 ]}

Actualmente, el método habitual en laboratorios para producir proteínas con fines de investigación es el uso de vectores de expresión en un huésped de expresión. La mayoría de las proteínas se producen en E. coli , pero para las proteínas glicosiladas y aquellas con enlaces disulfuro, se pueden utilizar levaduras, baculovirus y sistemas de mamíferos.

La mayoría de los fármacos proteicos se producen actualmente mediante tecnología de ADN recombinante utilizando vectores de expresión. Estos fármacos peptídicos y proteicos pueden ser hormonas, vacunas, antibióticos, anticuerpos y enzimas. ^{[ 43 ]} La primera proteína recombinante humana utilizada para el tratamiento de enfermedades, la insulina, se introdujo en 1982. ^{[ 43 ]} La biotecnología permite producir en grandes cantidades estos fármacos peptídicos y proteicos, algunos de los cuales antes eran raros o difíciles de obtener. También reduce los riesgos de contaminantes como virus del huésped, toxinas y priones . Ejemplos del pasado incluyen la contaminación por priones en la hormona del crecimiento extraída de glándulas pituitarias obtenidas de cadáveres humanos, que causó la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en pacientes que recibían tratamiento para el enanismo , ^{[ 44 ]} y contaminantes virales en el factor de coagulación VIII aislado de sangre humana que resultó en la transmisión de enfermedades virales como la hepatitis y el SIDA . ^{[ 45 ] [ 46 ]} Este riesgo se reduce o se elimina por completo cuando las proteínas se producen en células huésped no humanas.

En los últimos años, se han utilizado vectores de expresión para introducir genes específicos en plantas y animales para producir organismos transgénicos ; por ejemplo, en la agricultura se utilizan para producir plantas transgénicas . Los vectores de expresión se han utilizado para introducir un precursor de la vitamina A , el betacaroteno , en plantas de arroz. Este producto se llama arroz dorado . Este proceso también se ha utilizado para introducir un gen en plantas que produce un insecticida , llamado toxina de Bacillus thuringiensis o toxina Bt , lo que reduce la necesidad de que los agricultores apliquen insecticidas, ya que es producido por el organismo modificado. Además, los vectores de expresión se utilizan para prolongar la maduración de los tomates alterando la planta para que produzca menos de la sustancia química que causa la pudrición de los tomates. ^{[ 47 ]} Ha habido controversias sobre el uso de vectores de expresión para modificar cultivos debido a que podrían existir riesgos desconocidos para la salud, la posibilidad de que las empresas patenten ciertos cultivos alimentarios genéticamente modificados y preocupaciones éticas. Sin embargo, esta técnica todavía se utiliza y se investiga intensamente.

También se han producido animales transgénicos para estudiar procesos bioquímicos animales y enfermedades humanas, o para producir fármacos y otras proteínas. Asimismo, pueden modificarse genéticamente para que presenten características ventajosas o útiles. En ocasiones, se utiliza la proteína verde fluorescente como marcador, lo que da como resultado animales que pueden fluorescer; esto se ha aprovechado comercialmente para producir el pez fluorescente GloFish .

La terapia génica es un tratamiento prometedor para varias enfermedades en el que un gen "normal", transportado por un vector, se inserta en el genoma para reemplazar un gen "anormal" o complementar la expresión de un gen específico. Generalmente se utilizan vectores virales, pero se están desarrollando otros métodos de administración no virales. El tratamiento sigue siendo una opción arriesgada debido al vector viral utilizado, que puede causar efectos adversos, como mutaciones por inserción que pueden derivar en cáncer. ^{[ 48 ] [ 49 ]} Sin embargo, se han obtenido resultados prometedores. ^{[ 50 ] [ 51 ]}

Los vectores de expresión son herramientas fundamentales en biología molecular y biotecnología para dirigir la expresión de genes clonados en células huésped, lo que permite estudiar la función génica y producir proteínas recombinantes. Debido a su amplio uso en la investigación, los vectores de expresión de referencia se conservan en centros públicos de recursos biológicos y repositorios sin ánimo de lucro, lo que facilita el acceso a materiales estandarizados para científicos de todo el mundo; entre estos repositorios se incluyen BCCM/GeneCorner y Addgene.

• Vector de clonación
• proteína de la célula huésped

• Manual del sistema de fusión genética GST archivado el 5 de diciembre de 2008 en Wayback Machine.