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Sistema binario de transferencia de ADN

Un sistema binario de ADN de transferencia ( ADN-T ) es un par de plásmidos que consisten en un vector binario de ADN-T y un plásmido auxiliar vir . [ 1 ] [ 2 ] Los dos plásmido...

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Un sistema binario de ADN de transferencia ( ADN-T ) es un par de plásmidos que consisten en un vector binario de ADN-T y un plásmido auxiliar vir . [ 1 ] [ 2 ] Los dos plásmidos se utilizan juntos (de ahí el nombre binario [ 2 ] [ 3 ] ) para producir plantas genéticamente modificadas . Son vectores artificiales que se han derivado del plásmido Ti que se encuentra de forma natural en especies bacterianas del género Agrobacterium , como A. tumefaciens . El vector binario es un vector lanzadera , llamado así porque es capaz de replicarse en múltiples huéspedes (por ejemplo, Escherichia coli y Agrobacterium ).

Los sistemas en los que el ADN-T y los genes vir se encuentran en replicones separados se denominan sistemas binarios de ADN-T. El ADN-T se localiza en el vector binario (la región no-ADN-T de este vector, que contiene orígenes de replicación que podrían funcionar tanto en E. coli como en Agrobacterium , y genes de resistencia a antibióticos utilizados para seleccionar la presencia del vector binario en bacterias, se conoce como secuencias del esqueleto del vector). El replicón que contiene los genes vir se conoce como plásmido auxiliar vir . El plásmido auxiliar vir se considera inactivo si no contiene oncogenes que puedan transferirse a una planta.

Antecedentes de la transformación mediada por Agrobacterium

El sistema binario de transferencia de ADN se deriva del mecanismo de infección natural de las plantas por Agrobacterium tumefaciens . [ 4 ] Agrobacterium es una bacteria parásita que se encuentra naturalmente en los suelos e infecta las células vegetales para utilizar sus procesos y maquinaria biológica, integrando su propio material genético en el genoma de la célula vegetal para producir recursos que sustentan su supervivencia. [ 5 ]

plásmido Ti

Agrobacterium contiene un plásmido , una pieza circular de ADN, llamada "plásmido inductor de tumores" (o "plásmido Ti" para abreviar). [ 4 ] El plásmido Ti contiene los siguientes elementos:

La región "ADN-T": La región ADN-T es la sección del plásmido que se integra al genoma de la célula vegetal huésped. Agrobacterium utiliza la maquinaria de transcripción y traducción de la planta para expresar los genes ubicados dentro de la región ADN-T. [ 5 ] Contiene los siguientes elementos:

  • Bordes izquierdo y derecho (BL y BD): Los bordes izquierdo y derecho definen los límites de la región del ADN-T. [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] El BD actúa como punto de partida para la transferencia genética y el BL actúa como punto final. Los bordes son reconocidos y cortados por las endonucleasas codificadas por el gen virD . [ 5 ]
  • Genes de auxina y citoquinina: Estos genes codifican y fuerzan a la célula vegetal a producir auxina y citoquinina , [ 5 ] [ 6 ] hormonas vegetales que promueven la división y el crecimiento celular. [ 5 ] Al inducir la división celular, las células infectadas se reproducen más rápidamente, [ 5 ] aumentando la población de células que contienen el T-DNA, produciendo consecuentemente más opinas. Esta rápida división celular conduce a la formación de tumores llamados agallas de la corona. [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]
  • Genes de opina: Los genes de opina codifican y fuerzan a la célula vegetal a expresar enzimas que sintetizan opina, un compuesto rico en carbono y nitrógeno que actúa como fuente de alimento para Agrobacterium . [ 5 ] [ 6 ] Después de la síntesis, las opinas se secretan al espacio intercelular y al entorno circundante, lo que permite que sean absorbidas por Agrobacterium cercano . Las opinas más comunes producidas por células vegetales infectadas con ADN de Agrobacterium son la nopalina y la octopina . [ 5 ] [ 8 ]

Genes del catabolismo de la opina: Los genes del catabolismo de la opina codifican elementos de la vía metabólica de la opina de Agrobacterium. [ 5 ] Esta vía permite a la bacteria degradar y utilizar la opina como fuente de energía. [ 5 ] [ 6 ] Solo los portadores de este plásmido son capaces de metabolizar la opina, lo que les proporciona una ventaja competitiva sobre otros microbios del suelo. [ 5 ]

Casete de genes vir : Los genes vir , o "genes de virulencia", codifican elementos que ayudan en la transferencia del ADN-T del plásmido Ti al genoma de la célula vegetal. [ 4 ] [ 5 ] Hay 6 operones vir involucrados en la transferencia del ADN-T: virA, virB, virG, virC, virD y virE . [ 5 ] [ 6 ]

Ori : El ori es el "origen de replicación", un sitio en el plásmido donde las dos hebras de ADN comienzan a desenrollarse para permitir la replicación del ADN durante la división celular . [ 5 ] [ 8 ]

Las bacterias son organismos procariotas y las plantas son organismos eucariotas . Los mecanismos y la maquinaria involucrados en la expresión génica difieren en organismos procariotas y eucariotas. [ 8 ] Agrobacterium ha evolucionado para contener elementos genéticos eucariotas en la región T-DNA, lo que permite que los genes codificados en la región se expresen en las células vegetales. [ 6 ] [ 8 ] El plásmido Ti restante se adhiere a los procesos procariotas regulares. [ 8 ]

En la ingeniería genética de plantas, [ 6 ] los genes de auxina, citoquinina y opina se reemplazan con un "gen o genes de interés", el o los genes que se insertarán en la planta. [ 8 ] Los genes del catabolismo de la opina también se eliminan. [ 8 ] La transferencia del o los genes de interés de Agrobacterium a la célula vegetal ocurre a través del mecanismo de infección natural de la bacteria. [ 6 ]

Mecanismo de infección

El mecanismo natural de infección de las células vegetales por Agrobacterium está mediado por los 6 genes vir ubicados en el plásmido Ti. [ 4 ] El proceso de infección ocurre en 2 pasos generales:

  1. Reconocimiento de la célula vegetal y activación de la expresión del gen vir : Cuando la pared celular de una planta se daña, se liberan compuestos fenólicos como la acetosiringona al medio circundante. [ 4 ] Estos compuestos se unen a las quinasas receptoras transmembrana ubicadas en la membrana de Agrobacterium cercano , señalizando a la bacteria que hay una célula vegetal dañada cerca. Las quinasas receptoras están codificadas por virA . La unión del compuesto fenólico al dominio extracelular del receptor provoca la fosforilación del dominio intracelular . El grupo fosfato se desplaza del receptor a una proteína efectora flotante codificada por virG . [ 6 ] El efector fosforilado se activa y se une a elementos cis dentro de la región promotora de los 4 genes vir restantes , induciendo su expresión. [ 4 ] [ 6 ]
  2. Transferencia de T-ADN: El gen virD expresa una endonucleasa que reconoce la secuencia RB. La endonucleasa corta una hebra de la RB [ 4 ] [ 5 ] y se une covalentemente al extremo cortado 5' de la hebra de T-ADN. [ 4 ] [ 7 ] La ​​ruptura en el ADN activa los mecanismos naturales de reparación del ADN de la célula , que comienzan a sintetizar una nueva hebra de T-ADN a partir del extremo cortado 3' de la RB. Esta nueva hebra empuja la hebra original de T-ADN lejos. Mientras esto ocurre, las proteínas de unión a ADN monocatenario (proteínas de unión a ssADN), codificadas por virE , se unen a lo largo de la longitud del T-ADN original para estabilizarlo y evitar que se degrade. [ 4 ] [ 6 ] Otra endonucleasa virD reconoce y corta una hebra en el LB, liberando la hebra original de T-ADN del plásmido. [ 4 ] [ 5 ] El gen virB expresa proteínas que forman un canal de transporte entre Agrobacterium y las células vegetales, actuando como un puente físico a lo largo del cual el T-ADN se mueve de un organismo a otro. [ 6 ] Las proteínas virC ayudan a reclutar endonucleasas virD a los bordes y a dirigir el T-ADN liberado al canal de transporte virB . [ 6 ]

El T-ADN se integra entonces en una ubicación aleatoria dentro del genoma de la célula vegetal. [ 4 ] [ 6 ]

La siguiente tabla resume los genes vir y su función:

Componentes del sistema vectorial binario

Vector binario

Representación esquemática de un vector binario utilizado en la transformación de plantas mediada por Agrobacterium.

En ingeniería genética vegetal, se utiliza un vector binario para transferir genes extraños a las células vegetales . La razón para tener dos plásmidos separados es que resulta más fácil clonar y manipular los genes de interés en E. coli utilizando el vector T-DNA, ya que es pequeño y fácil de manejar, mientras que los genes vir permanecen en Agrobacterium en el plásmido auxiliar para facilitar la transformación de la planta. [ 10 ] Los componentes del vector binario incluyen:

  • Bordes izquierdo y derecho: El vector binario también contiene bordes izquierdo y derecho (LB y RB), que definen los límites de la región T-ADN que se transferirá al genoma de la planta . Estas secuencias de borde sirven como sitios de reconocimiento para las enzimas endonucleasas de Agrobacterium, que cortan y escinden el ADN para permitir su transferencia al núcleo de la célula vegetal . [ 11 ]
    • Dentro de la región T-DNA, se encuentran varios elementos funcionales. Primero, contiene el gen de interés que codifica la proteína funcional que los investigadores pretenden introducir en la planta. Segundo, fusionado al gen de interés, se encuentra un gen reportero que permite visualizar y cuantificar la integración génica exitosa en la planta. Los genes reporteros utilizados pueden ser el gen lac Z de E. coli , que produce un color azul al teñirse, y la GFP (proteína fluorescente verde), que fluoresce bajo luz ultravioleta. [ 12 ] También se introduce un promotor que dirige la expresión del gen de interés dentro de las células vegetales. Los promotores comúnmente utilizados incluyen el promotor CaMV 35S y el promotor UBQ10 para la expresión constitutiva. [ 13 ] Finalmente, una secuencia terminadora señala el final de la transcripción, asegurando que el gen se exprese de manera adecuada y consistente en la célula vegetal. [ 14 ]
    • Dentro del T-ADN también se encuentra el marcador de selección vegetal . Este marcador permite seleccionar las plantas que han integrado con éxito el transgén y el T-ADN en su genoma nuclear. Cuando las plantas transformadas se exponen a un marcador como un herbicida (p. ej., fosfinotricina) o un antibiótico (p. ej., kanamicina), solo aquellas que hayan integrado con éxito el transgén y el gen del marcador de selección sobrevivirán y crecerán. Las células que no hayan integrado el transgén serán sensibles al marcador y no sobrevivirán en condiciones selectivas. [ 15 ]
  • Los vectores binarios también contienen elementos necesarios para la replicación y selección bacteriana fuera de la región del ADN-T. Un marcador de selección bacteriana permite seleccionar las células de E. coli que han incorporado con éxito el plásmido binario durante la clonación y amplificación. Ejemplos de marcadores de selección bacteriana incluyen genes de resistencia a antibióticos como la ampicilina (AmpR) y la kanamicina (KanR). [ 15 ]
  • El vector también incluye un origen de replicación para E. coli , lo que garantiza que el plásmido sea reconocido por la maquinaria de replicación bacteriana y se replique cada vez que las células de E. coli se dividen. [ 16 ] Además, el vector binario contiene un origen de replicación para Agrobacterium , necesario para asegurar que el plásmido pueda replicarse dentro de las células de Agrobacterium . Después de la clonación y amplificación en E. coli , el plásmido se transfiere a Agrobacterium para la transformación de plantas. El origen de replicación para Agrobacterium asegura que el plásmido se mantenga y, a medida que las células de Agrobacterium se dividen, lo hace disponible para la transferencia de T-DNA durante el proceso de infección de la planta. [ 16 ]

La combinación de estos componentes convierte a los vectores binarios en herramientas versátiles y eficaces para la ingeniería genética de plantas, lo que permite a los investigadores modificar y amplificar plásmidos de manera eficiente en E. coli antes de introducirlos en Agrobacterium para la transformación de plantas.

A continuación se muestran series representativas de vectores binarios.

plásmido auxiliar Vir

El plásmido auxiliar vir contiene los genes vir que se originaron del plásmido Ti de Agrobacterium . Estos genes codifican una serie de proteínas que cortan el vector binario en las secuencias de los bordes izquierdo y derecho, y facilitan la transferencia e integración del T-ADN a las células y genomas de la planta, respectivamente. [ 24 ]

Se han descrito varios plásmidos auxiliares vir , [ 25 ] y las cepas comunes de Agrobacterium que incluyen plásmidos auxiliares vir son:

  • EHA101
  • EHA105
  • AGL-1
  • LBA4404
  • GV2260

El plásmido Ti original de Agrobacterium tumefaciens contiene tanto la región T-ADN como los genes vir necesarios para el procesamiento y la transferencia del T-ADN. [ 26 ] El plásmido es grande y a menudo puede superar los 200 kb de longitud y es estructuralmente complejo, lo que plantea desafíos para la manipulación genética y la clonación. [ 26 ] [ 27 ] Para superar estas limitaciones, se pueden utilizar dos plásmidos en lugar de uno: un vector binario y un plásmido auxiliar vir. [ 28 ] [ 29 ]

1) Plásmido vector binario : un vector pequeño que contiene el borde de T-DNA que flanquea el transgén de interés y genes marcadores seleccionables para la selección tanto de plantas como de bacterias. [ 26 ] [ 28 ] [ 30 ]

2) Plásmido auxiliar Vir : contiene el conjunto completo de genes de virulencia, pero carece de la secuencia de ADN-T. Proporciona la maquinaria necesaria para mediar la escisión y transferencia del ADN-T. No introduce ADN extraño en el genoma de la planta. [ 26 ] [ 28 ] [ 27 ]

Ventajas de utilizar dos plásmidos

  1. Modularidad : se pueden introducir múltiples vectores que portan diferentes genes de interés en una sola cepa vir sin alterar el plásmido auxiliar. Esto permite a los investigadores diseñar y manipular de forma independiente la región T-DNA sin afectar la maquinaria de virulencia [1,4]. [ 26 ] [ 30 ]
    1. Construcción independiente : Dado que los genes de virulencia (vir) se mantienen en un plásmido separado, los investigadores pueden modificar libremente el casete de T-DNA dentro del vector binario sin comprometer la competencia de transformación. [ 26 ]
    2. Reutilización : Una sola cepa de Agrobacterium que contiene un plásmido auxiliar vir estable puede utilizarse para introducir una amplia variedad de vectores binarios. Esto elimina la necesidad de reconstruir el plásmido completo para cada nueva construcción de transgén. [ 29 ] [ 30 ]
  2. Eficiencia : los vectores de tamaño pequeño pueden ayudar a mejorar la eficiencia de la transformación y facilitar el uso de estrategias de clonación. [ 29 ] [ 31 ] [ 32 ]
    1. Tamaño de vector más pequeño: El vector binario, que suele tener un tamaño de entre 10 y 15 kb, es significativamente más pequeño que el plásmido Ti real, que tiene un tamaño de más de 200 kb. Esto facilita enormemente su clonación y propagación en E. coli y Agrobacterium . [ 26 ] [ 29 ]
    2. Fidelidad de clonación mejorada : La complejidad reducida del vector binario disminuye la probabilidad de eventos de recombinación o inestabilidad del plásmido durante la propagación. [ 31 ]
    3. Mayores tasas de transformación : Los vectores binarios pueden diseñarse con promotores fuertes y específicos de tejido, y transgenes optimizados para codones, lo que conduce a una alta eficiencia de expresión e integración en el tejido vegetal objetivo. [ 29 ] [ 32 ]

La adopción del sistema binario de ADN-T de dos plásmidos ha revolucionado la ingeniería genética vegetal al mejorar la flexibilidad y la eficiencia de la transformación. Al separar el casete del transgén de la maquinaria de virulencia, los investigadores pueden realizar modificaciones genéticas precisas. Estas ventajas han convertido al sistema binario en el sistema estándar para la transformación mediada por Agrobacterium tanto en el ámbito académico como en el industrial. [ 26 ] [ 28 ] [ 29 ]

Desarrollo de vectores binarios de T-DNA

El vector pBIN19 se desarrolló en la década de 1980 y es uno de los primeros y más utilizados vectores binarios. El vector pGreen, desarrollado en el año 2000, es una versión más reciente del vector binario que permite la selección de promotores, marcadores seleccionables y genes reporteros. Otra característica distintiva de pGreen es su gran reducción de tamaño (de aproximadamente 11,7 kbp a 4,6 kbp) con respecto a pBIN19, lo que aumenta su eficiencia de transformación . [ 33 ]

Además de una mayor eficiencia de transformación, pGreen ha sido diseñado para garantizar la integridad de la transformación. Tanto pBIN19 como pGreen suelen usar el mismo marcador seleccionable nptII , pero pBIN19 lo tiene junto al borde derecho, mientras que pGreen lo tiene cerca del borde izquierdo. Debido a una diferencia de polaridad entre los bordes izquierdo y derecho, el borde derecho del T-DNA entra primero en la planta huésped. Si el marcador seleccionable está cerca del borde derecho (como ocurre con pBIN19) y el proceso de transformación se interrumpe, la planta resultante puede tener expresión del marcador seleccionable pero no contener T-DNA, lo que da lugar a un falso positivo. El vector pGreen tiene el marcador seleccionable entrando en el huésped en último lugar (debido a su ubicación junto al borde izquierdo), por lo que cualquier expresión del marcador dará como resultado la integración completa del transgén. [ 24 ]

Los vectores basados ​​en pGreen no son autónomos y no se replicarán en Agrobacterium si pSoup no está presente. Una serie de pequeños vectores binarios que se replican de forma autónoma en E. coli y Agrobacterium incluye:

  • pCB [ 19 ]
  • pLSU [ 22 ]
  • pLX [ 23 ]

Aplicaciones del sistema de vectores binarios en ingeniería genética

El sistema binario T-DNA ha sido una aplicación instrumental importante en la ingeniería genética de plantas. Su versatilidad permite la entrega eficiente de transgenes a diversas especies vegetales. [ 26 ] [ 31 ] Este concepto ha dado lugar a varias áreas de aplicación clave que han beneficiado al mundo real.

Generación de cultivos transgénicos

El sistema binario T-DNA se utilizó para desarrollar cultivos genéticamente modificados (GM) con características mejoradas. [ 31 ] [ 28 ]

maíz resistente a los insectos

Se ha utilizado un sistema binario para insertar genes de toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) en cultivos, confiriendo resistencia a las plagas. [ 34 ] Pero las toxinas, como Cry1Ac o Cry2Ab, son altamente específicas para ciertas plagas de insectos y no dañan a los humanos, insectos beneficiosos ni otros organismos no objetivo. [ 34 ] [ 35 ]

Acción y pasos de Bt: [ 35 ] [ 36 ]

  1. Los insectos se alimentan de los cristales y las esporas de Bt que se producen por el transgén en el genoma de la planta.
  2. La toxina se une a receptores específicos en el genoma y los insectos dejan de comer.
  3. El cristal provoca la ruptura de la pared intestinal, permitiendo que las esporas y las bacterias intestinales normales entren en el cuerpo.
  4. El insecto muere en forma de esporas y las bacterias proliferan en el cuerpo.

Arroz dorado

El sistema binario T-DNA se utilizó para introducir múltiples genes para diseñar la biosíntesis de provitamina A en el endospermo del arroz, abordando la deficiencia de vitamina A en los países en desarrollo. [ 37 ] [ 38 ] La deficiencia de vitamina A es una causa importante de ceguera prevenible y aumenta la susceptibilidad a enfermedades infecciosas como en los niños. [ 38 ] Los dos genes psy y crtl se insertaron en la región T-DNA de un plásmido binario en el genoma nuclear del arroz y se colocaron bajo el control de un promotor específico del endospermo, de modo que solo se expresan en el endospermo para asegurar la expresión en la parte comestible del grano. [ 37 ] Esto ilustra el poder del sistema binario T-DNA para diseñar vías metabólicas complejas de manera específica de tejido. [ 37 ] El uso de estrategias de transformación se puede aprovechar para producir cultivos nutricionalmente mejorados con importantes beneficios para la salud pública. [ 38 ] [ 39 ] El sistema binario T-DNA ha permitido la inserción precisa y estable de genes de importancia agrícola en los genomas de los cultivos. [ 26 ] [ 28 ] Mediante el desarrollo de cultivos resistentes a insectos y fortificados nutricionalmente, esta tecnología ha contribuido significativamente a la agricultura sostenible, la seguridad alimentaria y la mejora de la salud pública. [ 31 ] [ 28 ] [ 38 ] Las aplicaciones en el mundo real subrayan la versatilidad y el impacto del sistema binario como parte fundamental de la ingeniería genética. [ 26 ] [ 31 ] [ 28 ]

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