Transferencia de ADN

El ADN de transferencia (abreviado T-ADN ) es el ADN transferido del plásmido inductor de tumores (Ti) / inductor de raíces (Ri) de bacterias fitopatógenas como Agrobacterium tumefaciens , Rhizobium rhizogenes y Allorhizobium vitis (todas consideradas vagamente como Agrobacterium ). ^{[ 1 ]} El T-ADN se transfiere de la bacteria al genoma del ADN nuclear de la planta huésped . ^{[ 2 ]} La capacidad de este plásmido especializado inductor de tumores (Ti) se atribuye a dos regiones esenciales requeridas para la transferencia de ADN a la célula huésped. El T-ADN está bordeado por repeticiones de 25 pares de bases en cada extremo. La transferencia se inicia en el borde derecho y termina en el borde izquierdo. La transferencia requiere los genes vir del plásmido Ti, que no se transfieren a la planta.

El T-ADN de A. fabrum C58 tiene aproximadamente 24.000 pares de bases de longitud ^{[ 3 ] [ 4 ]} y contiene genes expresados ​​en la planta que codifican enzimas que sintetizan opinas y fitohormonas . Al transferir el T-ADN al genoma de la planta, la bacteria esencialmente reprograma las células vegetales para que crezcan formando un tumor y produzcan una fuente de alimento única para la bacteria. La síntesis de las hormonas vegetales auxina y citoquinina por enzimas codificadas en el T-ADN permite que la célula vegetal crezca en exceso, formando así los tumores de agalla de la corona típicamente inducidos por la infección de Agrobacterium . Las opinas son derivados de aminoácidos que la bacteria utiliza como fuente de carbono y energía, con los genes de utilización ubicados en partes del plásmido que no se transfieren a la planta. ^{[ 5 ]} Rhizobium rhizogenes causa una infección similar conocida como enfermedad de la raíz pilosa . Tiene genes de síntesis de opinas similares, pero genes diferentes que causan el crecimiento excesivo. ^{[ 1 ]}

Este proceso natural de transferencia horizontal de genes en plantas se está utilizando como herramienta para la investigación fundamental y aplicada en biología vegetal a través de la transformación de genes extraños mediada por Agrobacterium y la mutagénesis por inserción. ^{[ 6 ] [ 7 ]} Los genomas de las plantas se pueden diseñar mediante el uso de Agrobacterium para la entrega de secuencias alojadas en vectores binarios de T-DNA , que separan los genes vir del T-DNA.

Algunos plásmidos Ti/Ri tienen no uno, sino dos fragmentos de ADN-T bordeados por repeticiones. Ambos se transfieren a la planta. Este tipo de configuración se denomina ADN-T _L y ADN- T _R. ^{[ 1 ]}

El proceso de infección del T-ADN en la célula huésped y su integración en su núcleo implica múltiples pasos. Primero, las bacterias se multiplican en la savia de la herida antes de la infección y luego se adhieren a las paredes celulares de la planta. La expresión de los genes de virulencia bacteriana de aproximadamente 10 operones se activa por la percepción de compuestos fenólicos como la acetosiringona emitida por el tejido vegetal herido y tras el contacto célula-célula. Luego, este proceso continúa con la translocación macromolecular de Agrobacterium al citoplasma de la célula huésped, la transmisión del T-ADN junto con las proteínas asociadas (llamadas complejo T ) al núcleo de la célula huésped, seguida del desensamblaje del complejo T, la integración estable del T-ADN en el genoma de la planta huésped y la eventual expresión de los genes transferidos . La integración del T-ADN en un genoma huésped implica la formación de una muesca de cadena simple en el ADN en el borde derecho del plásmido Ti. Esta muesca crea una región de ADN de cadena simple desde el borde izquierdo del gen del T-ADN hasta el borde derecho que fue cortado. Luego, las proteínas de unión a cadena simple se unen al ADN de cadena simple. La síntesis de ADN desplaza la región de cadena simple y, posteriormente, una segunda muesca en la región del borde izquierdo libera el fragmento de ADN-T de cadena simple. Este fragmento puede incorporarse al genoma del huésped. ^{[ 8 ]}

Se sabe que Agrobacterium ha desarrollado un sistema de control que utiliza factores del huésped vegetal y procesos celulares para varias vías de respuesta de defensa del huésped vegetal para invadir el núcleo de la célula huésped. Para la integración del T-ADN en el genoma del huésped objetivo, Agrobacterium lleva a cabo múltiples interacciones con factores de la planta huésped. ^{[ 8 ]} Para interactuar con las proteínas de la planta huésped, muchas proteínas de virulencia de Agrobacterium están codificadas por genes vir. La expresión del gen vir de Agrobacterium ocurre a través del sensor VirA-VirG que da como resultado la generación de una copia móvil de T-ADN monocatenario (cadena T). Una forma procesada de VirB2 es el componente principal del complejo T que es necesario para la transformación. VirD2 es la proteína que cubre el extremo 5′ de la cadena T transferida por unión covalente y es transportada al citoplasma de la célula huésped. ^{[ 9 ] [ 10 ]} VirE2 es la proteína de unión al ADN monocatenario que presumiblemente recubre la cadena T en el citoplasma del huésped por unión cooperativa . Luego se dirige al núcleo mediante interacciones con proteínas de la célula huésped como importina a, VirE3 bacteriana y proteínas similares a la dineína. Otros efectores de virulencia bacteriana como VirB5, VirB7 (componentes menores del complejo T), VirD5, VirE2, VirE3 y VirF también pueden interactuar con proteínas de las células de la planta huésped. ^{[ 11 ]}

La transferencia de T-ADN mediada por Agrobacterium se utiliza ampliamente como herramienta en biotecnología . Durante más de dos décadas, Agrobacterium tumefaciens se ha explotado para introducir genes en plantas para investigación básica, así como para la producción comercial de cultivos transgénicos . ^{[ 12 ]} En ingeniería genética , los genes promotores de tumores y de síntesis de opinas se eliminan del T-ADN y se reemplazan con un gen de interés y/o un marcador de selección, que es necesario para establecer qué plantas se han transformado con éxito. Ejemplos de marcadores de selección incluyen la neomicina fosfotransferasa, la higromicina B fosfotransferasa (que fosforilan antibióticos) y la fosfinotricina acetiltransferasa (que acetila y desactiva la fosfinotricina , un potente inhibidor de la glutamina sintetasa ) o formulaciones de herbicidas como Basta o Bialophos. ^{[ 13 ]} Otro sistema de selección que se puede emplear es el uso de marcadores metabólicos como la fosfomanosa isomerasa. ^{[ 14 ]} Agrobacterium se utiliza entonces como vector para transferir el T-DNA modificado a las células vegetales, donde se integra en el genoma de la planta. Este método se puede utilizar para generar plantas transgénicas que portan un gen extraño. Agrobacterium tumefaciens es capaz de transferir ADN extraño tanto a plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas de manera eficiente, teniendo en cuenta factores de vital importancia como el genotipo de las plantas, los tipos y edades de los tejidos inoculados, el tipo de vectores, las cepas de Agrobacterium , los genes marcadores de selección y los agentes selectivos, y diversas condiciones de cultivo de tejidos. ^{[ 5 ]}

El mismo procedimiento de transferencia de T-DNA puede utilizarse para interrumpir genes mediante mutagénesis por inserción . ^{[ 7 ]} La secuencia de T-DNA insertada no solo crea una mutación, sino que su inserción también "marca" ^{[ 15 ]} el gen afectado, lo que permite su aislamiento como secuencias flanqueantes de T-DNA. Se puede vincular un gen reportero al extremo derecho del T-DNA que se va a transformar junto con un replicón de plásmido y un gen de resistencia a antibióticos seleccionable (como la higromicina ), y puede expresar aproximadamente el 30% de la eficiencia promedio de las fusiones génicas inducidas por inserciones exitosas de T-DNA en Arabidopsis thaliana . ^{[ 16 ]}

La genética inversa implica probar la supuesta función de un gen conocido mediante su interrupción y luego buscar el efecto de esa mutación inducida en el fenotipo del organismo. La mutagénesis por marcaje con T-DNA implica el cribado de poblaciones mediante mutaciones de inserción de T-DNA. Las colecciones de mutaciones de T-DNA conocidas proporcionan recursos para estudiar las funciones de genes individuales, como se ha desarrollado para la planta modelo Arabidopsis thaliana . ^{[ 17 ] [ 18 ]} Ejemplos de mutaciones de inserción de T-DNA en Arabidopsis thaliana incluyen aquellas asociadas con muchas clases de fenotipos, incluyendo letales en plántulas, variantes de tamaño, variantes de pigmentación, defectos embrionarios, fertilidad reducida y plantas morfológica o fisiológicamente aberrantes. ^{[ 19 ]}

• Sistema binario de transferencia de ADN