Vector de transformación vegetal

Los vectores de transformación vegetal son plásmidos diseñados específicamente para facilitar la generación de plantas transgénicas . Los vectores de transformación vegetal más utilizados son los vectores binarios de ADN-T , que suelen replicarse tanto en E. coli , una bacteria común de laboratorio , como en Agrobacterium tumefaciens , una bacteria virulenta para las plantas que se utiliza para insertar el ADN recombinante en ellas.

Los vectores de transformación vegetal contienen tres elementos clave:

• Selección de plásmidos (creación de una cadena circular de ADN personalizada)
• Replicación de plásmidos (para que se pueda trabajar con ellos fácilmente)
• Región de ADN de transferencia (ADN-T) (inserción del ADN en la agrobacteria)

Se puede crear y replicar una secuencia de plásmido de ADN personalizada de varias maneras, pero en general, todos los métodos comparten los siguientes procesos:

La transformación de plantas mediante plásmidos comienza con la propagación del vector binario en E. coli. Cuando el cultivo bacteriano alcanza la densidad adecuada, el vector binario se aísla y purifica. Posteriormente, se puede introducir un gen foráneo. El vector binario modificado, que incluye el gen foráneo, se reintroduce en E. coli para su amplificación.

El factor binario modificado se aísla de E. coli y se introduce en Agrobacteria que contiene un plásmido Ti modificado (relativamente pequeño). Esta Agrobacteria modificada genéticamente puede utilizarse para infectar células vegetales. El ADN-T, que contiene el gen extraño, se integra en el genoma de la célula vegetal. En cada célula infectada, el ADN-T se integra en una posición diferente del genoma.

La planta entera se regenerará a partir de una sola célula transformada, dando como resultado un organismo con el ADN transformado integrado de forma idéntica en todas las células.

Un gen selector permite distinguir las células modificadas genéticamente de las no modificadas. Este gen se integra en el plásmido junto con el gen diana deseado, confiriendo a las células resistencia a un antibiótico , como la kanamicina , la ampicilina , la espectinomicina o la tetraciclina . Las células deseadas, junto con cualquier otro organismo presente en el cultivo, pueden tratarse con el antibiótico, permitiendo la supervivencia únicamente de las células modificadas. El gen de la resistencia al antibiótico no suele transferirse a la célula vegetal, sino que permanece dentro de la célula bacteriana.

Los plásmidos se replican para producir numerosas moléculas de plásmido en cada célula bacteriana huésped. El número de copias de cada plásmido en una célula bacteriana está determinado por el origen de replicación , que es la posición dentro de la molécula de plásmido donde se inicia la replicación del ADN. La mayoría de los vectores binarios tienen un mayor número de copias de plásmido cuando se replican en E. coli ; sin embargo, el número de copias de plásmido suele ser menor cuando el plásmido reside en Agrobacterium tumefaciens . Los plásmidos también pueden replicarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

El ADN-T contiene dos tipos de genes: los genes oncogénicos , que codifican enzimas implicadas en la síntesis de auxinas y citoquininas y responsables de la formación de tumores , y los genes que codifican la síntesis de opinas . Estos compuestos, producidos por la condensación entre aminoácidos y azúcares, son sintetizados y excretados por las células de la agalla de la corona, y A. tumefaciens los consume como fuentes de carbono y nitrógeno.

Los genes implicados en el catabolismo de opinas , la transferencia de T-ADN de la bacteria a la célula vegetal y la transferencia conjugativa de plásmidos bacteria-bacteria se encuentran fuera del T-ADN. ^{[ 3 ] [ 4 ]} El fragmento de T-ADN está flanqueado por repeticiones directas de 25 pb, que actúan como una señal de elemento cis para el aparato de transferencia. El proceso de transferencia de T-ADN está mediado por la acción cooperativa de proteínas codificadas por genes determinados en la región de virulencia del plásmido Ti (genes vir) y en el cromosoma bacteriano. El plásmido Ti también contiene los genes para el catabolismo de opinas producido por las células de la agalla de la corona y regiones para la transferencia conjugativa y para su propia integridad y estabilidad. La región de virulencia (vir) de 30 kb es un regulón organizado en seis operones esenciales para la transferencia de T-ADN (virA, virB, virD y virG) o para el aumento de la eficiencia de transferencia (virC y virE). ^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]} Varios elementos genéticos determinados cromosómicamente han demostrado su función en la adhesión de A. tumefaciens a la célula vegetal y la colonización bacteriana. Los loci chvA y chvB están involucrados en la síntesis y excreción del β-1,2- glucano , ^{[ 6 ]} el chvE es necesario para la mejora del azúcar de la inducción de genes vir y la quimiotaxis bacteriana . ^{[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]} El locus cell es responsable de la síntesis de fibrillas de celulosa . ^{[ 10 ]} El locus pscA (exoC) está involucrado en la síntesis tanto de glucano cíclico como de succinoglicano ácido . ^{[ 11 ] [ 9 ]} El locus att está involucrado en las proteínas de la superficie celular . ^{[ 12 ]}

• Enfoque técnico: una guía para los vectores binarios Ti de Agrobacterium Tendencias en Ciencias Vegetales 5(10): 446-451 2000