Colocalización

En la microscopía de fluorescencia , la colocalización se refiere a la observación de la superposición espacial entre dos (o más) marcadores fluorescentes diferentes, cada uno con una longitud de onda de emisión distinta, para ver si los diferentes "objetivos" se encuentran en la misma área de la célula o muy cerca uno del otro. La definición se puede dividir en dos fenómenos diferentes: la coocurrencia, que se refiere a la presencia de dos fluoróforos (posiblemente no relacionados) en el mismo píxel, y la correlación, una relación estadística mucho más significativa entre los fluoróforos que indica una interacción biológica . ^{[ 1 ]} Esta técnica es importante para muchos estudios de biología celular y fisiología durante la demostración de una relación entre pares de biomoléculas.

La capacidad de demostrar una correlación entre un par de biomoléculas fue mejorada enormemente por Erik Manders de la Universidad de Ámsterdam, quien introdujo el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) para los microscopistas, ^{[ 2 ]} junto con otros coeficientes, de los cuales los "coeficientes de solapamiento" M1 y M2 han demostrado ser los más populares y útiles. ^{[ 3 ] [ 4 ]} El propósito de usar coeficientes es caracterizar el grado de solapamiento entre imágenes, generalmente dos canales en una imagen de microscopía multidimensional registrada en diferentes longitudes de onda de emisión. Un enfoque popular fue introducido por Sylvain Costes, quien utilizó el coeficiente de correlación de Pearson como herramienta para establecer los umbrales requeridos por M1 y M2 de manera objetiva. ^{[ 5 ]} El enfoque de Costes parte del supuesto de que solo las correlaciones positivas son de interés y no proporciona una medición útil del PCC.

Aunque el uso de coeficientes puede mejorar significativamente la fiabilidad de la detección de colocalización, depende de varios factores, incluidas las condiciones de preparación de las muestras con fluorescencia y la forma en que se adquirieron y procesaron las imágenes con colocalización. Los estudios deben realizarse con mucha precaución y tras una lectura cuidadosa de la bibliografía. Actualmente, el campo está plagado de confusión y aún no se ha establecido firmemente un enfoque estandarizado. ^{[ 6 ]} Los intentos de rectificar esto incluyen la reevaluación y revisión de algunos de los coeficientes, ^{[ 7 ] [ 8 ]} la aplicación de un factor para corregir el ruido, ^{[ 1 ]} "Correlaciones corregidas por ruido basadas en réplicas para mediciones precisas de colocalización". ^{[ 9 ]} y la propuesta de protocolos adicionales, ^{[ 10 ]} que fueron revisados ​​exhaustivamente por Bolte y Cordelieres (2006). ^{[ 6 ]} Además, debido a la tendencia de las imágenes de fluorescencia a contener cierta cantidad de señal fuera de foco, ruido de disparo de Poisson y otro ruido, generalmente requieren un preprocesamiento antes de la cuantificación. ^{[ 11 ] [ 12 ]} La restauración cuidadosa de imágenes mediante deconvolución elimina el ruido y aumenta el contraste en las imágenes, mejorando la calidad de los resultados del análisis de colocalización. Hasta ahora, los métodos más utilizados para cuantificar la colocalización calculan la correlación estadística de las intensidades de píxeles en dos canales de microscopía distintos. Estudios más recientes han demostrado que esto puede conducir a altos coeficientes de correlación incluso para objetivos que se sabe que residen en diferentes compartimentos celulares. ^{[ 13 ]} Se puede lograr una cuantificación más robusta de la colocalización combinando el reconocimiento digital de objetos, el cálculo de la superposición de áreas y la combinación con un valor de correlación de intensidad de píxeles. Esto condujo al concepto de un coeficiente de correlación de Pearson corregido por objetos. ^{[ 13 ]}

Algunos colorantes fluorescentes de zinc impermeables pueden marcar de forma detectable el citosol y los núcleos de células apoptóticas y necróticas en cada uno de los cuatro tipos de tejido examinados. A saber: la corteza cerebral , el hipocampo , el cerebelo , y también se demostró que la detección colocalizada del aumento de zinc y el indicador de muerte celular bien aceptado yoduro de propidio también ocurrió en células renales. Utilizando los principios de colocalización fluorescente, se demostró la detección coincidente de la acumulación de zinc y la captación de yoduro de propidio (un indicador tradicional de muerte celular) en múltiples tipos de células. ^{[ 14 ]} Se pueden encontrar varios ejemplos de cuantificación de colocalización en el campo de la neurociencia en una revisión. ^{[ 15 ]} Se pueden encontrar protocolos detallados sobre la cuantificación de colocalización en un capítulo de libro. ^{[ 16 ]}

La colocalización se utiliza en la microscopía de fluorescencia de molécula única en tiempo real para detectar interacciones entre especies moleculares marcadas con fluorescencia. En este caso, una especie (por ejemplo, una molécula de ADN) se inmoviliza en la superficie de imagen, y la otra especie (por ejemplo, una proteína de unión al ADN ) se añade a la solución. Ambas especies se marcan con colorantes de espectro resuelto (>50  nm), como la cianina-3 y la cianina-5. La excitación de la fluorescencia se realiza normalmente en modo de reflexión interna total , lo que aumenta la relación señal-ruido para las moléculas en la superficie con respecto a las moléculas en la solución. Las moléculas se detectan como puntos que aparecen en la superficie en tiempo real, y su ubicación se determina con una precisión de 10-20  nm mediante el ajuste de funciones de dispersión puntual. Dado que el tamaño típico de las biomoléculas es del orden de 10  nm, esta precisión suele ser suficiente para la detección de interacciones moleculares ^{[ 17 ].}

Para una mejor interpretación de los resultados de estudios de colocalización cualitativos y cuantitativos, se sugirió utilizar un conjunto de cinco variables lingüísticas vinculadas a los valores de los coeficientes de colocalización, tales como muy débil , débil , moderado , fuerte y muy fuerte , para describirlos. El enfoque se basa en el uso del modelo de sistema difuso y la simulación por computadora. Cuando se introducen nuevos coeficientes, sus valores se pueden ajustar al conjunto. ^{[ 18 ]}

• Transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET):  proximidad de 10 nm
  • ( Microscopía óptica :  resolución de solo 250 nm; no hay certeza de una interacción efectiva)
• Inmunoprecipitación (IP) / ensayos de pulldown
• Levadura híbrida 2: mapeo de interacciones proteicas

El grado de colocalización en imágenes de microscopía de fluorescencia se puede validar utilizando la Colocalization Benchmark Source , una colección gratuita de conjuntos de imágenes descargables con valores de colocalización predefinidos.