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dicroísmo circular

El dicroísmo circular (DC) es la absorción diferencial de luz polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha por una molécula quiral. El dicroísmo circular ( CD ) es un ...

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El dicroísmo circular (DC) es la absorción diferencial de luz polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha por una molécula quiral.

El dicroísmo circular ( CD ) es un dicroísmo que involucra luz polarizada circularmente , es decir, la absorción diferencial de luz levógira y dextrógira . [ 1 ] [ 2 ] La luz polarizada circularmente levógira (LHC) y dextrógira (RHC) representa dos posibles estados de momento angular de espín para un fotón, por lo que el dicroísmo circular también se conoce como dicroísmo para el momento angular de espín. [ 3 ] Este fenómeno fue descubierto por Jean-Baptiste Biot , Augustin Fresnel y Aimé Cotton en la primera mitad del siglo XIX. [ 4 ] El dicroísmo circular y la birrefringencia circular son manifestaciones de actividad óptica . Se exhibe en las bandas de absorción de moléculas quirales ópticamente activas . La espectroscopia de CD tiene una amplia gama de aplicaciones en muchos campos diferentes. En particular, el CD en el ultravioleta lejano se utiliza para investigar la estructura secundaria de las proteínas. [ 5 ] El CD UV/Vis se utiliza para investigar las transiciones de transferencia de carga . [ 6 ] El dicroísmo circular en el infrarrojo cercano se utiliza para investigar la estructura geométrica y electrónica mediante el estudio de las transiciones d → d de los metales . [ 2 ] El dicroísmo circular vibracional , que utiliza luz de la región de energía infrarroja , se utiliza para estudios estructurales de pequeñas moléculas orgánicas y, más recientemente, de proteínas y ADN. [ 5 ]

Principios físicos

Polarización circular de la luz

La radiación electromagnética consiste en un campo eléctrico.mi{\displaystyle {\boldsymbol {E}}}y magnéticoB{\displaystyle {\boldsymbol {B}}}campo que oscila perpendicularmente entre sí y a la dirección de propagación, [ 7 ] una onda transversal . Mientras que la luz polarizada linealmente ocurre cuando el vector del campo eléctrico oscila solo en un plano, la luz polarizada circularmente ocurre cuando la dirección del vector del campo eléctrico gira alrededor de su dirección de propagación mientras el vector mantiene una magnitud constante. En un punto del espacio, el vector polarizado circularmente trazará un círculo durante un período de la frecuencia de la onda, de ahí su nombre. Los dos diagramas a continuación muestran los vectores del campo eléctrico de la luz polarizada lineal y circularmente, en un instante dado, para un rango de posiciones; la gráfica del vector eléctrico polarizado circularmente forma una hélice a lo largo de la dirección de propagación.k{\displaystyle {\boldsymbol {k}}}. Para luz polarizada circularmente a la izquierda (LCP) con propagación hacia el observador, el vector eléctrico gira en sentido antihorario . [ 2 ] Para luz polarizada circularmente a la derecha (RCP), el vector eléctrico gira en sentido horario.

Interacción de la luz polarizada circularmente con la materia.

Cuando la luz polarizada circularmente pasa a través de un medio ópticamente activo absorbente, las velocidades entre las polarizaciones derecha e izquierda difieren (doL≠doR{\displaystyle c_{\mathrm {L}}\neq c_{\mathrm {R}}}) así como su longitud de onda (λL≠λR{\displaystyle \lambda _{\mathrm {L} }\neq \lambda _{\mathrm {R} }}) y el grado en que son absorbidos (εL≠εR{\displaystyle \varepsilon _{\mathrm {L} }\neq \varepsilon _{\mathrm {R} }}). El dicroísmo circular es la diferenciaΔε≡εL−εR{\displaystyle \Delta \varepsilon \equiv \varepsilon _{\mathrm {L} }-\varepsilon _{\mathrm {R} }}[ 5 ] El campo eléctrico de un haz de luz provoca un desplazamiento lineal de carga al interactuar con una molécula ( dipolo eléctrico ), mientras que su campo magnético provoca una circulación de carga ( dipolo magnético ). Estos dos movimientos combinados provocan una excitación de un electrón en un movimiento helicoidal, que incluye traslación y rotación y sus operadores asociados . La relación determinada experimentalmente entre la fuerza rotacionalR{\displaystyle R}de una muestra y laΔε{\displaystyle \Delta \varepsilon }es dado por

Rmiincógnitapag=3hdo103ln⁡(10)32π3norteA∫Δενdν{\displaystyle R_{\mathrm {exp} }={\frac {3hc10^{3}\ln(10)}{32\pi ^{3}N_{\mathrm {A} }}}\int {\frac {\Delta \varepsilon }{\nu }}\mathrm {d} {\nu }}

La fuerza de rotación también se ha determinado teóricamente,

Rthmio=12metrodoImetro∫ΨgramoMETRO^(milmido.dipagolmi)Ψmidτ∙∫ΨgramoMETRO^(metroagramo.dipagolmi)Ψmidτ{\displaystyle R_{\mathrm {theo} }={\frac {1}{2mc}}\mathrm {Im} \int \Psi _{g}{\widehat {M}}_{\mathrm {(elec.dipole)} }\Psi _{e}\mathrm {d} \tau \bullet \int \Psi _{g}{\widehat {M}}_{\mathrm {(mag.dipole)} }\Psi _{e}\mathrm {d} \tau }

Vemos en estas dos ecuaciones que para tener distinto de ceroΔε{\displaystyle \Delta \varepsilon }, los operadores de momento dipolar eléctrico y magnético (METRO^(milmido.dipagolmi){\displaystyle {\widehat {M}}_{\mathrm {(elec.dipole)} }}yMETRO^(metroagramo.dipagolmi){\displaystyle {\widehat {M}}_{\mathrm {(mag.dipole)} }}) debe transformarse como la misma representación irreducible .donorte{\displaystyle \mathrm {C} _{n}}yDnorte{\displaystyle \mathrm {D} _{n}}son los únicos grupos puntuales donde esto puede ocurrir, lo que hace que solo las moléculas quirales sean activas CD.

En pocas palabras, dado que la luz polarizada circularmente es quiral, interactúa de manera diferente con las moléculas quirales . Es decir, los dos tipos de luz polarizada circularmente se absorben en distinta medida. En un experimento de dicroísmo circular (DC), se irradian alternativamente cantidades iguales de luz polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha, de una longitud de onda seleccionada, sobre una muestra (quiral). Una de las dos polarizaciones se absorbe más que la otra, y esta diferencia de absorción, que depende de la longitud de onda, se mide, obteniendo así el espectro de DC de la muestra. Debido a la interacción con la molécula, el vector del campo eléctrico de la luz describe una trayectoria elíptica tras atravesar la muestra.

Es importante que la quiralidad de la molécula sea conformacional en lugar de estructural. Es decir, por ejemplo, una molécula de proteína con una estructura secundaria helicoidal puede tener un dicroísmo circular (DC) que cambia con los cambios en la conformación.

absorbancia delta

Por definición,

ΔA=AL−AR{\displaystyle \Delta A=A_{\mathrm {L} }-A_{\mathrm {R} }\,}

dóndeΔA{\displaystyle \Delta A}La (Delta Absorbancia) es la diferencia entre la absorbancia de la luz polarizada circularmente a la izquierda (LCP) y la luz polarizada circularmente a la derecha (RCP) (esto es lo que se suele medir).ΔA{\displaystyle \Delta A}es una función de la longitud de onda , por lo que para que una medición sea significativa, se debe conocer la longitud de onda a la que se realizó.

dicroísmo circular molar

También puede expresarse, aplicando la ley de Beer , como:

ΔA=(εL−εR)dol{\displaystyle \Delta A=(\varepsilon _{\mathrm {L} }-\varepsilon _{\mathrm {R} })Cl\,}

dónde

εL{\displaystyle \varepsilon _{\mathrm {L} }}yεR{\displaystyle \varepsilon _{\mathrm {R} }}son los coeficientes de extinción molar para luz LCP y RCP,
do{\displaystyle C}es la concentración molar ,
l{\displaystyle l}es la longitud del camino en centímetros (cm).

Entonces

Δε=εL−εR{\displaystyle \Delta \varepsilon =\varepsilon _{\mathrm {L} }-\varepsilon _{\mathrm {R} }\,}

es el dicroísmo circular molar. Esta propiedad intrínseca es lo que generalmente se entiende por dicroísmo circular de la sustancia. Dado queΔε{\displaystyle \Delta \varepsilon }es una función de la longitud de onda, un valor de dicroísmo circular molar (Δε{\displaystyle \Delta \varepsilon }) debe especificar la longitud de onda en la que es válida.

Efectos extrínsecos sobre el dicroísmo circular

En muchas aplicaciones prácticas del dicroísmo circular (DC), como se explica más adelante, el DC medido no es simplemente una propiedad intrínseca de la molécula, sino que depende de su conformación. En tal caso, el DC también puede ser función de la temperatura, la concentración y el entorno químico, incluidos los disolventes. Por lo tanto, para que el valor de DC reportado sea significativo, debe especificar estos otros factores relevantes.

En estructuras ordenadas que carecen de simetría rotacional doble, la actividad óptica, [ 8 ] [ 9 ] incluyendo la transmisión diferencial [ 10 ] (y reflexión [ 11 ] ) de ondas polarizadas circularmente también depende de la dirección de propagación a través del material. En este caso, la denominada quiralidad 3D extrínseca se asocia con la orientación mutua del haz de luz y la estructura.

Elipticidad molar

A pesar deΔA{\displaystyle \Delta A}Por lo general se mide, por razones históricas la mayoría de las mediciones se informan en grados de elipticidad. La elipticidad molar es el dicroísmo circular corregido por concentración. Dicroísmo circular molar y elipticidad molar,[θ]{\displaystyle [\theta ]}, se interconvierten fácilmente mediante la ecuación:

La luz polarizada elípticamente (violeta) se compone de contribuciones desiguales de luz polarizada circularmente a la derecha (azul) y a la izquierda (roja).
[θ]=3298.2Δε.{\displaystyle [\theta ]=3298.2\,\Delta \varepsilon .\,}

Esta relación se deriva definiendo la elipticidad de la polarización como:

broncearse⁡θ=miR−miLmiR+miL{\displaystyle \tan \theta ={\frac {E_{\mathrm {R} }-E_{\mathrm {L} }}{E_{\mathrm {R} }+E_{\mathrm {L} }}}\,}

dónde

miR{\displaystyle E_{\mathrm {R} }}ymiL{\displaystyle E_{\mathrm {L} }}son las magnitudes de los vectores del campo eléctrico de la luz polarizada circularmente a la derecha y circularmente a la izquierda, respectivamente.

CuandomiR{\displaystyle E_{\mathrm {R} }}igualmiL{\displaystyle E_{\mathrm {L} }}(cuando no hay diferencia en la absorbancia de la luz polarizada circularmente a la derecha y a la izquierda),θ{\displaystyle \theta }es 0° y la luz está polarizada linealmente . CuandomiR{\displaystyle E_{\mathrm {R} }}omiL{\displaystyle E_{\mathrm {L} }}es igual a cero (cuando hay una absorción completa de la luz polarizada circularmente en una dirección),θ{\displaystyle \theta }es de 45° y la luz está polarizada circularmente .

Generalmente, el efecto de dicroísmo circular es pequeño, por lo quebroncearse⁡θ{\displaystyle \tan \theta }es pequeño y puede aproximarse comoθ{\displaystyle \theta }en radianes . Dado que la intensidad o irradiancia ,I{\displaystyle I}, de luz es proporcional al cuadrado del vector del campo eléctrico, la elipticidad se convierte en:

θ(radianes)=(IR1/2−IL1/2)(IR1/2+IL1/2){\displaystyle \theta ({\text{radians}})={\frac {(I_{\mathrm {R} }^{1/2}-I_{\mathrm {L} }^{1/2})}{(I_{\mathrm {R} }^{1/2}+I_{\mathrm {L} }^{1/2})}}\,}

Luego, sustituyendo I usando la ley de Beer en forma de logaritmo natural :

I=I0mi−Aln⁡10{\displaystyle I=I_{0}\mathrm {e} ^{-A\ln 10}\,}

La elipticidad ahora se puede escribir como:

θ(radianes)=(mi−AR2ln⁡10−mi−AL2ln⁡10)(mi−AR2ln⁡10+mi−AL2ln⁡10)=miΔAln⁡102−1miΔAln⁡102+1{\displaystyle \theta ({\text{radians}})={\frac {(\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {R} }}{2}}\ln 10}-\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {L} }}{2}}\ln 10})}{(\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {R} }}{2}}\ln 10}+\mathrm {e} ^{{\frac {-A_{\mathrm {L} }}{2}}\ln 10})}}={\frac {\mathrm {e} ^{\Delta A{\frac {\ln 10}{2}}}-1}{\mathrm {e} ^{\Delta A{\frac {\ln 10}{2}}}+1}}\,}

DesdeΔA≪1{\displaystyle \Delta A\ll 1}, esta expresión se puede aproximar expandiendo las exponenciales en una serie de Taylor hasta primer orden y luego descartando términos deΔA{\displaystyle \Delta A}en comparación con la unidad y la conversión de radianes a grados:

θ(títulos)=ΔA(ln⁡104)(180π){\displaystyle \theta ({\text{degrees}})=\Delta A\left({\frac {\ln 10}{4}}\right)\left({\frac {180}{\pi }}\right)\,}

La dependencia lineal de la concentración del soluto y la longitud del camino se elimina definiendo la elipticidad molar como,

[θ]=100θdol{\displaystyle [\theta ]={\frac {100\theta }{Cl}}\,}

Luego, combinando las dos últimas expresiones con la ley de Beer , la elipticidad molar se convierte en:

[θ]=100Δε(ln⁡104)(180π)=3298.2Δε{\displaystyle [\theta ]=100\,\Delta \varepsilon \left({\frac {\ln 10}{4}}\right)\left({\frac {180}{\pi }}\right)=3298.2\,\Delta \varepsilon \,}

Las unidades de elipticidad molar son históricamente (grados·cm² / dmol). Para calcular la elipticidad molar, se deben conocer la concentración de la muestra (g/L), la longitud del paso óptico (cm) y el peso molecular (g/mol).

Si la muestra es una proteína, a menudo se utiliza el peso molecular medio (peso molecular promedio de los residuos de aminoácidos que contiene) en lugar del peso molecular, tratando esencialmente la proteína como una solución de aminoácidos. El uso de la elipticidad media por residuo facilita la comparación del dicroísmo circular (DC) de proteínas de diferente peso molecular; el uso de este DC normalizado es importante en los estudios de la estructura de las proteínas.

Elipticidad media de los residuos

Los métodos para estimar la estructura secundaria en polímeros, especialmente en proteínas y polipéptidos, suelen requerir la conversión del espectro de elipticidad molar medido a un valor normalizado, es decir, un valor independiente de la longitud del polímero. Para ello, se utiliza la elipticidad media por residuo, que se obtiene dividiendo la elipticidad molar medida de la molécula entre el número de unidades monoméricas (residuos) que la componen.

Aplicación a moléculas biológicas

Panel superior: Espectroscopia de dicroísmo circular en la región de longitud de onda ultravioleta lejana (CD UV lejana) de la proteína de fusión MBP-citocromo b 6 en diferentes soluciones de detergente. Muestra que la proteína en DM, así como en solución de Triton X-100, recuperó su estructura. Sin embargo, los espectros obtenidos de la solución de SDS muestran una elipticidad disminuida en el rango entre 200 y 210  nm, lo que indica una recuperación incompleta de la estructura secundaria. Panel inferior: Contenido de estructuras secundarias predicho a partir de los espectros de CD utilizando el algoritmo CDSSTR. La proteína en solución de SDS muestra un mayor contenido de estructuras desordenadas y un menor contenido de hélices. [ 12 ]

La espectroscopia de dicroísmo circular (DC) es una herramienta poderosa en la investigación biofísica y bioquímica, que proporciona información única sobre las características estructurales y de estabilidad de las biomoléculas. Dado que el DC surge de la absorción diferencial de luz polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha por moléculas ópticamente activas , es intrínsecamente sensible a la quiralidad de las macromoléculas biológicas. Esto la hace particularmente valiosa para el análisis de estructuras secundarias, como se observa en las firmas espectrales de DC características de las hélices α y las láminas β de las proteínas y las dobles hélices de los ácidos nucleicos . Mientras que las técnicas de alta resolución, como la cristalografía de rayos X , la RMN y la crio-EM, revelan detalles estructurales a nivel atómico, y los métodos basados ​​en la interacción, como la ITC y la SPR , estudian las interacciones moleculares, la espectroscopia de DC ofrece un método rápido y sin marcadores para detectar cambios estructurales y variaciones de estabilidad. Su capacidad para proporcionar datos complementarios la convierte en un componente esencial del conjunto de herramientas biofísicas modernas, con aplicaciones que abarcan prácticamente todos los campos de la investigación biomolecular. La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) se utiliza ampliamente en el ámbito académico y en la industria biofarmacéutica para estudiar biomoléculas, en particular proteínas y péptidos. Los espectros de CD proporcionan información valiosa sobre la estructura secundaria y terciaria .

La información sobre la estructura secundaria se deriva de señales que surgen de los enlaces peptídicos que absorben en el rango del ultravioleta lejano (que abarca aproximadamente de 180  nm a 260  nm), lo que permite la identificación y las asignaciones fraccionarias de elementos estructurales como la hélice alfa , la lámina beta , el giro beta y la bobina aleatoria . [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] Estas asignaciones estructurales imponen restricciones importantes sobre las posibles conformaciones secundarias en las que puede estar la proteína. El CD no puede, en general, decir dónde se encuentran las hélices alfa que se detectan dentro de la molécula ni siquiera predecir completamente cuántas hay. A pesar de esto, el CD es una herramienta valiosa, especialmente para mostrar cambios en la conformación. Se puede utilizar, por ejemplo, para estudiar cómo cambia la estructura secundaria de una molécula en función de la temperatura (en un experimento de rampa de temperatura de desnaturalización térmica) o de la concentración de agentes desnaturalizantes (en un experimento de desnaturalización química), por ejemplo, cloruro de guanidinio o urea . De esta forma, puede revelar información termodinámica importante sobre la molécula (como la entalpía y la energía libre de Gibbs de desnaturalización) que de otro modo no se podría obtener fácilmente. Cualquiera que intente estudiar una proteína encontrará en la espectroscopia de dicroísmo circular (CD) una herramienta valiosa para verificar que la proteína se encuentra en su conformación nativa (es decir, como técnica de control de calidad) antes de emprender experimentos extensos y/o costosos con ella. Además, la espectroscopia de CD se ha utilizado en estudios de interfaces bioinorgánicas ; específicamente, se ha utilizado para analizar las diferencias en la estructura secundaria de una proteína modificada antes y después de la titulación con un reactivo. [ 17 ]

La información sobre la estructura terciaria se obtiene a partir de las contribuciones espectrales de los aminoácidos aromáticos , que absorben en el rango del ultravioleta cercano (aproximadamente de 250  nm a 350  nm). Las señales obtenidas en esta región se deben a la absorción, la orientación dipolar y la naturaleza del entorno de los aminoácidos fenilalanina, tirosina, cisteína (o puentes disulfuro SS ) y triptófano . A diferencia del dicroísmo circular en el ultravioleta lejano, el espectro de dicroísmo circular en el ultravioleta cercano no puede asignarse a ninguna estructura tridimensional en particular. Más bien, el rango del ultravioleta cercano puede considerarse una región de huella dactilar, ya que su perfil espectral depende exquisitamente de la composición de los residuos aromáticos y de la conformación y el entorno de sus cadenas laterales.

Los espectros de dicroísmo circular (DC) visibles (que abarcan aproximadamente de 350  nm a 700  nm) proporcionan información estructural sobre la naturaleza de los grupos prostéticos en las proteínas, por ejemplo, los grupos hemo en la hemoglobina y el citocromo c . La espectroscopia de DC visible es una técnica muy potente para estudiar las interacciones metal-proteína y puede resolver transiciones electrónicas d-d individuales como bandas separadas. Los espectros de DC en la región de la luz visible generalmente solo se producen cuando un ion metálico se encuentra en un entorno quiral; por lo tanto, los iones metálicos libres en solución no se detectan. Esto tiene la ventaja de observar solo el metal unido a la proteína, por lo que la dependencia del pH y las estequiometrías se obtienen fácilmente. La actividad óptica en complejos de iones de metales de transición se ha atribuido a efectos configuracionales, conformacionales y vecinales. Klewpatinond y Viles (2007) han producido un conjunto de reglas empíricas para predecir la aparición de espectros de DC visibles para complejos plano-cuadrados de Cu(II) y Ni(II) que involucran histidina y coordinación de la cadena principal. [ 18 ]

Más allá de las proteínas y los péptidos, la espectroscopia UV-CD es una herramienta poderosa para caracterizar la estructura secundaria de los ácidos nucleicos, proporcionando información sobre las hélices de ADN y los motivos estructurales del ARN, como los G-cuadruplexos. Las diferentes conformaciones del ADN (ADN-A, ADN-B y ADN-Z) exhiben firmas espectrales de CD distintas debido a variaciones en el apilamiento de bases y la geometría helicoidal. [ 19 ] [ 20 ] De manera similar, las estructuras de ARN, incluyendo bucles de tallo, pseudonudos y G-cuadruplexos, producen espectros de CD únicos que reflejan sus patrones de plegamiento específicos e interacciones de bases. Los G-cuadruplexos, en particular, muestran bandas positivas y negativas características en el espectro de CD dependiendo de su topología (paralela, antiparalela o híbrida). [ 21 ] Estas características espectrales hacen de la UV-CD una técnica esencial para estudiar el plegamiento, la estabilidad y las interacciones de los ácidos nucleicos con ligandos.

La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) proporciona información estructural menos específica que la cristalografía de rayos X y la espectroscopia de RMN de proteínas , por ejemplo, las cuales ofrecen datos con resolución atómica. Sin embargo, la espectroscopia de CD es un método rápido que no requiere grandes cantidades de proteínas ni un procesamiento de datos extenso. Por lo tanto, la CD puede utilizarse para analizar diversas condiciones de disolvente , como la temperatura , el pH , la salinidad y la presencia de varios cofactores.

La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) se utiliza habitualmente para estudiar proteínas en solución, complementando así los métodos que estudian el estado sólido. Sin embargo, esto también supone una limitación, ya que muchas proteínas se encuentran incrustadas en membranas en su estado nativo, y las soluciones que contienen estructuras de membrana suelen presentar una fuerte dispersión. El CD también puede medirse en películas delgadas y polvos. Por ejemplo, se ha realizado espectroscopia de CD en materiales semiconductores de estado sólido, como el TiO₂ , para obtener señales intensas en el rango de longitud de onda ultravioleta, donde suelen producirse las transiciones electrónicas de las biomoléculas. [ 22 ]

Comparaciones de estructuras de orden superior

La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) de proteínas moderna es sumamente eficaz para el análisis comparativo de la estructura secundaria y terciaria, comúnmente conocida como análisis de estructura de orden superior (HOS). Algunos ejemplos incluyen la evaluación de la consistencia entre lotes en biofármacos, la evaluación de los efectos de las mutaciones y el estudio de las propiedades de variantes de carga o glicovariantes de una proteína original. El análisis HOS también es muy eficaz para estudiar el impacto de los excipientes de la formulación, el pH y la fuerza iónica en la conformación de las proteínas.

Las comparaciones HOS tienen una amplia gama de aplicaciones y desempeñan un papel fundamental en cada etapa del desarrollo de bioterapéuticos, desde las evaluaciones analíticas iniciales hasta el control de calidad en etapas avanzadas; desde el desarrollo de la formulación hasta las evaluaciones de estabilidad en almacenamiento tras la degradación forzada.

Las comparaciones de estructuras de orden superior aprovechan los rangos de longitud de onda del ultravioleta lejano y cercano para permitir un análisis de datos estadísticamente robusto, reproducible y cuantificable. Una comparación de HOS evalúa cuantitativamente si dos espectros cualesquiera difieren y, por extensión, si su información estructural subyacente es diferente. Esto suele ser difícil, si no imposible, de determinar mediante inspección visual. Detectar estas sutiles diferencias requiere múltiples espectros independientes y un análisis estadístico robusto, ya que muchas variaciones son demasiado pequeñas para ser discernibles a simple vista.

Gráfico de diferencia espectral ponderada (WSD) que compara lotes de muestras del producto innovador con los del biosimilar. Si los valores de WSD de suficientes réplicas de muestra se encuentran dentro del rango de calidad, la muestra se considera similar a la de referencia; de lo contrario, se considera diferente.

Existen diversos enfoques para las comparaciones de HOS y en la literatura se describen numerosos métodos de comparación espectral. Sin embargo, independientemente del método o la aplicación, todos son métodos matemáticos que tienen el mismo objetivo: obtener un único valor como medida de similitud para comparaciones espectrales por pares. Un ejemplo de este método es el de Diferencia Espectral Ponderada (WSD), un método de comparación de HOS preferido por muchas empresas biofarmacéuticas y autoridades reguladoras. [ 23 ] [ 24 ]

Durante la última década, las comparaciones HOS se han consolidado como una herramienta esencial para unificar los datos de CD en las solicitudes de aprobación de nuevos fármacos biológicos. En particular, en el desarrollo de biosimilares, las comparaciones HOS son indispensables para cumplir con los requisitos de la FDA, la EMA y otros organismos reguladores. El objetivo de esta guía es regular y controlar la seguridad, la calidad y la eficacia de los agentes terapéuticos disponibles para el público. [ 25 ]

Fluorescencia

Las mediciones de fluorescencia en espectroscopia de dicroísmo circular (CD), registradas a 90 grados respecto a la luz incidente, suelen servir como canal de datos complementario, proporcionando información adicional sobre la estabilidad de las proteínas y los cambios conformacionales. Al detectar la fluorescencia intrínseca de residuos aromáticos como el triptófano y la tirosina, los investigadores pueden evaluar los cambios ambientales que acompañan a las transiciones estructurales. Los datos de fluorescencia pueden adquirirse junto con las señales de CD, especialmente en experimentos de rampa de temperatura, donde ayudan a monitorizar los eventos de desplegamiento mediante el seguimiento de los cambios en la intensidad de emisión o los desplazamientos de longitud de onda. Este proceso podría seguirse registrando espectros de CD a intervalos de 1  °C, por ejemplo, mientras se aumenta la temperatura continuamente a 1  °C por minuto. El ancho de banda de excitación requerido para los espectros de fluorescencia suele ser mayor que el que se usaría como ancho de banda espectral para las mediciones de CD, por lo que a veces es necesario utilizar diferentes anchos de banda espectrales para las mediciones de CD y fluorescencia. Este enfoque dual mejora la interpretación del comportamiento de las proteínas en diversas condiciones, aumentando la confianza en las evaluaciones estructurales y de estabilidad.

Existen diversos métodos para recopilar datos de fluorescencia, entre ellos el uso de un tubo fotomultiplicador (PMT) para registrar la fluorescencia total, el uso de un fluorómetro CCD para registrar la fluorescencia de espectro completo o el uso de un monocromador de emisión de barrido (SEM) para permitir el escaneo del espectro de fluorescencia a una longitud de onda de excitación fija.

Dispersión rotatoria óptica (ORD)

La dicroísmo circular (DC) está estrechamente relacionada con la técnica de dispersión rotatoria óptica (DRO). La rotación óptica es la rotación de la luz polarizada linealmente al atravesar un material ópticamente activo, y es consecuencia de la diferencia en el índice de refracción entre las componentes polarizadas circularmente a la izquierda y a la derecha (la luz polarizada linealmente puede considerarse una combinación equitativa de luz polarizada circularmente a la derecha y a la izquierda). La dispersión rotatoria óptica es la variación de la rotación óptica con la longitud de onda. Los espectros de DRO y DC se derivan de la interacción de la luz polarizada (circular o linealmente) con moléculas quirales y están directamente relacionados: cada uno puede derivarse del otro mediante la transformada de Kramers-Kronig . Las mediciones de DRO y DC proporcionan esencialmente la misma información, pero experimentalmente cada técnica se ha preferido para aplicaciones particulares. La DC es la técnica de mayor resolución, ya que solo se observa en longitudes de onda donde la molécula quiral absorbe luz. Esto facilita la interpretación de espectros complejos que involucran múltiples bandas de absorbancia. Alternativamente, las mediciones de DRO pueden obtenerse en longitudes de onda donde la molécula quiral que se está midiendo no necesariamente absorbe luz. Esto significa que las mediciones de ORD pueden realizarse en materiales con altas concentraciones o donde las bandas de absorbancia están enmascaradas por la absorbancia del disolvente o de la sal tampón. La ORD es particularmente útil para azúcares no sustituidos, ya que esta clase de biomoléculas no posee cromóforos que absorban en las regiones UV-Vis accesibles mediante instrumentos de dicroísmo circular comerciales.

Dicroísmo lineal (DL)

Con el accesorio adecuado, es posible realizar mediciones de dicroísmo lineal (DL) en espectrofotómetros de dicroísmo circular (DC). El dicroísmo lineal es la diferencia en la absorbancia de la luz polarizada paralela y perpendicular a un eje de orientación.

ΔA = A para - A perpendicular

donde A es la absorbancia de la luz polarizada linealmente, y los subíndices indican paralelo y perpendicular, respectivamente. Para que una muestra tenga un LD distinto de cero, debe ser anisotrópica; la anisotropía puede ser intrínseca, como en los cristales líquidos, por ejemplo, o puede ser inducida, por ejemplo, al estirar una película de polímero, al aplicar un campo eléctrico o al alinear o deformar en un campo de cizallamiento (por ejemplo, ácidos nucleicos como el ADN).

Un dispositivo LD utiliza una celda de Couette para generar un campo de cizallamiento. La muestra se encuentra en el espacio anular entre dos cilindros concéntricos de cuarzo; el exterior, el rotor, gira sobre su eje cilíndrico, mientras que el interior, el estator, permanece fijo. Este sistema recibe su nombre de su creador, Maurice Couette .

La cizalladura puede provocar que las partículas grandes en el líquido se alineen o se deformen. Por ejemplo, las partículas rígidas en forma de varilla, como los nanotubos de carbono y las fibras de vidrio, se alinearán, mientras que las vesículas, las micelas y los polímeros flexibles se deformarán respecto a sus conformaciones de equilibrio, extendiéndose en la dirección de la cizalladura. El dicroísmo lineal se utiliza entonces para determinar la dirección de la transferencia neta de electrones en un cromóforo absorbido con respecto a la dirección de la cizalladura y, por lo tanto, con respecto a la dirección de alineación de la especie absorbente o la dirección de deformación de su entorno.

Para obtener más información sobre LD y su medición, consulte este libro. [ 26 ]

Dicroísmo circular magnético (DCM)

El dicroísmo circular magnético (DCM) es la absorción diferencial de luz polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha en presencia de un campo magnético paralelo a la dirección de propagación de la luz. El DCM se diferencia del dicroísmo circular natural en que no requiere una muestra quiral; además, los orígenes del DCM y del DCM son bastante distintos.

Un espectro de dicroísmo circular magnético (DCM) consta de tres componentes, conocidas como términos A, B y C. A temperatura ambiente, los términos A y B predominan, especialmente en el caso de cromóforos no magnéticos, y constituyen la mayor parte de lo que se puede observar en un experimento estándar de DCM.

El término A se debe al desdoblamiento de Zeeman de estados excitados degenerados por una diferencia de espín. El resultado es un pequeño desplazamiento en las longitudes de onda del espectro UV-Visible para cada estado de espín, donde cada estado absorbe preferentemente luz polarizada circularmente a la izquierda o a la derecha. El espectro MCD del término A se observa como una derivada de una transición de absorbancia con una transición abrupta alrededor del pico de absorbancia. Debido a las bandas del término A, el espectro MCD está más estructurado que el espectro de absorbancia o el espectro de dicroísmo circular natural, se pueden cuantificar múltiples cromóforos superpuestos con mucha más facilidad y se pueden rastrear los cambios en cromóforos individuales.

El término B se debe a la mezcla de estados fundamentales no degenerados. Normalmente se observa como un pico de banda de absorción único, que puede ser positivo o negativo.

El término C se debe a cambios en las poblaciones de moléculas sobre los subniveles de Zeeman como consecuencia de la respuesta al campo de un estado fundamental paramagnético. Estos cambios se vuelven significativos en el espectro MCD solo a temperaturas muy bajas, y los requisitos de instrumentación, que incluyen campos magnéticos intensos y temperaturas criogénicas, son muy similares a los de la técnica relacionada de resonancia paramagnética electrónica (RPE). Se trata de un sistema costoso y especializado, por lo que el acceso a los términos C está fuera del alcance de un accesorio MCD fácilmente intercambiable en un espectrómetro de dicroísmo circular de sobremesa.

La recopilación de datos de dicroísmo circular magnético (DCM) es similar a la del dicroísmo circular natural (DC), con la diferencia de que existen dos posibles orientaciones del imán, con el polo norte o el polo sur más cerca del detector. Normalmente, se adquiere un espectro con el imán en cada orientación; dado que la contribución del DCM al espectro cambia de signo al invertir el campo magnético, mientras que la contribución del DC natural no, ambas contribuciones pueden obtenerse promediando los dos espectros.

Para obtener más información sobre MCD, consulte este libro. [ 27 ]

Luminiscencia polarizada circularmente (CPL)

La luminiscencia polarizada circularmente (CPL) es el análogo de emisión de la dicroísmo circular (CD). Mientras que el CD examina la geometría de las moléculas en su estado fundamental, la CPL, que generalmente se observa perpendicularmente al haz de luz incidente, proporciona información sobre la geometría de las moléculas en su estado excitado o luminiscente. En un experimento de CPL, la luz emitida se analiza para determinar su contenido de luz polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha.

La diferencia de intensidad entre la luz emitida polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha, ΔI , viene dada por:

Δ I = I L – I R

donde I L e I R son la intensidad de la luz emitida polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha, respectivamente. La intensidad de luminiscencia promedio viene dada por:

I = ( I L + I R ) / 2

Tanto ΔI como I se expresan en unidades relativas porque en los experimentos de luminiscencia no se detecta toda la luz luminiscente, sino solo la que se encuentra dentro de un ángulo sólido restringido. Además, puede resultar difícil obtener un valor absoluto para la concentración de moléculas luminiscentes. Por estas razones, se define un factor de disimetría en la luminiscencia como:

g lum = Δ I / I

donde glum es un número absoluto que es único para cada molécula activa de CPL bajo condiciones específicas.

Muchos espectrofotómetros de dicroísmo circular disponibles comercialmente pueden adaptarse con un accesorio para medir la luminiscencia polarizada circularmente de una muestra.

Análisis de muestras sólidas

Es posible analizar muestras en estado sólido mediante espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Existen varias opciones para lograrlo.

Las muestras suelen prepararse en forma de discos, ya sea por compresión con un dispersante inerte como el bromuro de potasio o el cloruro de potasio, o mediante la deposición de la muestra como una película delgada sobre el disco. Esta técnica está bien establecida en la espectroscopia de absorbancia infrarroja y también se ha utilizado en la espectroscopia UV/visible. La muestra se mide en modo de transmisión, con la luz atravesándola hasta un detector montado en el puerto de transmisión del espectrómetro. Para eliminar el efecto de la anisotropía , la muestra se suele montar en una rueda y se puede girar manualmente para realizar mediciones en varias posiciones angulares. Posteriormente, se pueden promediar los espectros de todas las posiciones.

Si las muestras sólidas se presentan en forma de polvo, se pueden medir mediante reflectancia difusa utilizando un dispositivo conocido como esfera integradora .

Las esferas integradoras se desarrollaron a principios del siglo XX y se utilizaron originalmente para medir la emisión total de una fuente de luz sin tener en cuenta la dirección original de la luz. Actualmente se utilizan comúnmente para medir los espectros de absorción UV/visible o IR de muestras sólidas, y su uso puede extenderse a la espectroscopia de dicroísmo circular UV/visible de sólidos.

La luz entra en la esfera a través de un puerto de entrada, y las superficies internas de la esfera suelen ser blancas, reflectantes y difusas, de modo que la luz se distribuye uniformemente dentro de la esfera mediante reflexiones de dispersión múltiple. Se coloca un detector en un puerto de salida y se mide la intensidad de la luz. Para la espectroscopia de dicroísmo circular (CD), la muestra puede colocarse en el puerto de entrada, de modo que la luz la atraviese antes de entrar en la esfera, o en un punto de la esfera opuesto al puerto de entrada, de modo que la luz se refleje difusamente en la muestra después de entrar en la esfera. Estos dos modos de operación se denominan transmisión y reflectancia difusa, respectivamente. En ambos casos, la muestra se prepara en forma de polvo. Para el modo de transmisión, debe dispersarse en bromuro de potasio o cloruro de potasio y comprimirse en un disco. Para el modo de reflectancia difusa, permanece como polvo libre, disperso si es necesario en un diluyente como sulfato de bario o politetrafluoroetileno (PTFE).

Estudiando las reacciones rápidas

Muchos espectrofotómetros de dicroísmo circular (CD) disponibles comercialmente están diseñados para incorporar un dispositivo de flujo detenido que permite estudiar la cinética de reacciones rápidas en solución. En su forma más simple, las soluciones de dos reactivos se mezclan rápidamente al ser forzadas a través de una cámara de mezcla. Al salir de esta cámara, el fluido mezclado pasa a través de una celda de observación óptica. En un momento dado, el flujo se detiene repentinamente y la reacción se monitoriza mediante una sonda espectroscópica adecuada, como la absorbancia, la fluorescencia, la polarización de fluorescencia o el dicroísmo circular. Se registra la variación de la señal espectroscópica en función del tiempo y, posteriormente, se obtienen las constantes de velocidad que definen la cinética de la reacción ajustando los datos mediante un modelo apropiado.

Limitaciones experimentales

El dicroísmo circular ( DC) también se ha estudiado en carbohidratos , pero con un éxito limitado debido a las dificultades experimentales asociadas con la medición de espectros de DC en la región ultravioleta de vacío (UVV) del espectro (100 a 200  nm), donde se encuentran las bandas de DC correspondientes de los carbohidratos no sustituidos. Se han logrado medir con éxito carbohidratos sustituidos con bandas por encima de la región UVV.

Las soluciones tampón y las sales presentan una absorbancia sorprendentemente alta en el extremo inferior del rango ultravioleta lejano, y su contribución a la absorbancia total de la muestra debe tenerse en cuenta.

La medición de CD en el UV lejano también se complica por el hecho de que los sistemas típicos de tampón acuoso en concentraciones fisiológicas de tampón y sal a menudo absorben significativamente en el rango del UV lejano. El fosfato , Tris y HEPES son tolerados, pero la concentración debe minimizarse (por ejemplo, idealmente 10-20 mM). Las sales de tampón también exhiben una absorbancia sorprendentemente alta en el extremo inferior del rango del UV lejano y debe procurarse mantenerse por debajo de aproximadamente 50 mM (dependiendo de la longitud de trayectoria). Algunos experimentadores han sustituido el ion cloruro por fluoruro porque el fluoruro absorbe menos en el UV lejano, y algunos han trabajado en agua pura. Incluso el agua misma absorberá por debajo de aproximadamente 180  nm. Una solución notable incluye cambiar de H₂O a D₂O , lo que potencialmente permite mediciones hasta tan bajas como 171  nm. [ 28 ] Debido a que el CD es fundamentalmente una técnica de absorción y obedece la Ley de Beer , otro truco es minimizar la absorción del tampón utilizando celdas/cubetas de longitud de trayectoria más corta cuando se trabaja en el UV lejano; En este trabajo, las longitudes de trayectoria de 0,1 a 0,5  mm son habituales. Por otro lado, los experimentos en el ultravioleta cercano no presentan la mayoría de estas limitaciones y suelen realizarse a concentraciones más altas en  cubetas estándar de 10 mm de longitud de trayectoria. La concentración y la longitud de trayectoria forman un producto matemático que da como resultado la absorbancia y, por lo tanto, son linealmente intercambiables para obtener el mismo valor de absorbancia.

Además de medirse en sistemas acuosos, el dicroísmo circular (DC), en particular el DC en el ultravioleta lejano, puede medirse en disolventes orgánicos como etanol , metanol , acetonitrilo y trifluoroetanol (TFE) hasta diferentes porcentajes de disolvente orgánico. El TFE tiene la ventaja de ser bien tolerado e induce la formación de estructuras en las proteínas, generando láminas beta en algunas y hélices alfa en otras, lo cual no se observaría en condiciones acuosas normales. [ 29 ] Muchos disolventes orgánicos comunes, como la acetona , el tetrahidrofurano (THF) , el dioxano , el cloroformo y el diclorometano , son generalmente incompatibles con el DC en el ultravioleta lejano. [ 30 ]

Cabe destacar que los espectros de dicroísmo circular (DC) de proteínas utilizados en la estimación de la estructura secundaria están relacionados con las transiciones orbitales π a π* y n a π* de los enlaces amida en la cadena principal de los aminoácidos. Estas bandas de absorción se encuentran parcialmente en el ultravioleta de vacío (longitudes de onda inferiores a unos 200  nm). Esta región de interés es inaccesible en el aire debido a la fuerte absorción de luz por el oxígeno en dichas longitudes de onda, lo que también produce ozono. El ozono es un gas altamente reactivo que resulta perjudicial para la salud y para los componentes ópticos del espectrómetro. Además, incluso cantidades mínimas de oxígeno u ozono presentes en la lámpara o el monocromador dificultan la adquisición de datos de DC. El ozono presenta un pico de absorbancia amplio y pronunciado alrededor de los 250  nm, y otro pico amplio alrededor de los 600  nm, atenuando así la luz de la lámpara del espectrómetro en gran parte de su rango de longitudes de onda, especialmente en la región UV. En la práctica, estos espectros se miden no en el vacío, sino en un instrumento libre de oxígeno (purgado con gas nitrógeno de alta pureza procedente de un tanque o recipiente Dewar).

Una vez eliminado el oxígeno, quizás el segundo factor técnico más importante para trabajar por debajo de los 200  nm sea diseñar el resto del sistema óptico para que presente bajas pérdidas en esta región. En este sentido, resulta fundamental el uso de espejos aluminizados cuyos recubrimientos se hayan optimizado para minimizar las pérdidas en la región ultravioleta lejana del espectro.

La fuente de luz habitual en estos instrumentos es una lámpara de arco de xenón de alta presión . Las fuentes de luz de xenón son muy estables y producen un espectro de emisión amplio y uniforme, desde el ultravioleta lejano hasta el infrarrojo cercano . Las lámparas de arco de xenón comunes no son adecuadas para su uso en el ultravioleta bajo. En su lugar, deben utilizarse lámparas de arco de xenón especialmente diseñadas, con envolturas fabricadas con sílice fundida sintética de alta pureza .

La luz de las fuentes de sincrotrón tiene un flujo mucho mayor en longitudes de onda cortas y se ha utilizado para registrar CD hasta 160  nm. En 2010, el espectrofotómetro de CD en la instalación de anillo de almacenamiento de electrones ISA en la Universidad de Aarhus en Dinamarca se utilizó para registrar espectros de CD de estado sólido hasta 120  nm. [ 31 ] A nivel de mecánica cuántica , la densidad de características del dicroísmo circular y la rotación óptica son idénticas. La dispersión rotatoria óptica y el dicroísmo circular comparten el mismo contenido de información cuántica .

Véase también

Referencias

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  • Un tutorial animado paso a paso sobre dicroísmo circular y rotación óptica, impartido por el profesor Valev.
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