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Ensayo de ácido bicinchonínico

Ensayo de proteínas BCA en una placa de 96 pocillos El ensayo de ácido bicinchonínico ( ensayo BCA ), también conocido como ensayo de Smith , en honor a su inventor, Paul K. Smi...

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Ensayo de proteínas BCA en una placa de 96 pocillos

El ensayo de ácido bicinchonínico ( ensayo BCA ), también conocido como ensayo de Smith , en honor a su inventor, Paul K. Smith de Pierce Chemical Company , [ 1 ] es un ensayo bioquímico para determinar la concentración total de proteína en una solución (de 0,5 μg/mL a 1,5 mg/mL), similar al ensayo de Lowry , al ensayo de Bradford o al reactivo de Biuret . La concentración total de proteína se manifiesta mediante un cambio de color de la solución de muestra, de azul a púrpura, proporcional a la concentración de proteína, que luego se puede medir utilizando técnicas colorimétricas . El ensayo BCA fue patentado por Pierce Chemical Company en 1989 y la patente expiró en 2006. [ 2 ] 

Mecanismo

Una solución madre de BCA contiene los siguientes ingredientes en una solución altamente alcalina con un pH de 11,25: ácido bicinchonínico , carbonato de sodio , bicarbonato de sodio , tartrato de sodio y sulfato de cobre(II) pentahidratado.

El ensayo BCA se basa principalmente en dos reacciones. Primero, los enlaces peptídicos de la proteína reducen los iones Cu²⁺ del sulfato de cobre(II) a Cu¹⁺ ( una reacción dependiente de la temperatura). La cantidad de Cu²⁺ reducido es proporcional a la cantidad de proteína presente en la solución. A continuación, dos moléculas de ácido bicinchonínico se quelan con cada ion Cu¹⁺ , formando un complejo de color púrpura que absorbe fuertemente la luz a una longitud de onda de 562 nm .

El complejo de ácido bicinchonínico Cu¹⁺ se ve influenciado en muestras de proteínas por la presencia de cadenas laterales de cisteína/cistina, tirosina y triptófano. A temperaturas más elevadas (de 37 a 60  °C), los enlaces peptídicos favorecen la formación del complejo de reacción. Se recomienda incubar el ensayo BCA a temperaturas más altas para aumentar la sensibilidad del ensayo y minimizar las variaciones causadas por una composición desigual de aminoácidos. [ 3 ]

La cantidad de proteína presente en una solución se puede cuantificar midiendo los espectros de absorción y comparándolos con soluciones de proteínas de concentración conocida.

Limitaciones

El ensayo BCA es en gran medida incompatible con agentes reductores y quelantes de metales, aunque se pueden tolerar cantidades traza. [ 4 ] Según se informa, el ensayo BCA también responde a lípidos y fosfolípidos de membrana comunes. [ 5 ]

Variantes de ensayo

Existen algunas variantes alternativas del ensayo BCA:

Ensayo BCA original

Como lo describe Smith, [ 1 ] el ensayo BCA original es un protocolo de dos componentes. Los dos reactivos son "estables indefinidamente a temperatura ambiente". [ 1 ] Existen formulaciones modernas (probablemente exactas o muy similares) disponibles en al menos dos proveedores comerciales. [ 6 ] [ 7 ] La solución de trabajo BCA se genera mezclando el reactivo A y el reactivo B en una proporción de 50:1, y puede prepararse semanalmente (es moderadamente estable) o según sea necesario.

Reactivo A [ 1 ]

Una formulación alternativa sugerida pero no probada en el manuscrito de Smith consiste en omitir el NaOH (y presumiblemente no realizar el ajuste manual del pH a 11,25), sino disolver los demás componentes en un tampón previamente preparado de 0,25 M Na₂CO₃ y 0,01 M NaHCO₃ . [ 1 ]

Cabe destacar que Smith sintetizó su propio BCA mediante la reacción de Pfitzinger de isatina y acetoína , sustituyendo el KOH por NaOH, pero siguiendo el método sintético de Lesene y Henze, [ 8 ] ya que el BCA disponible en los proveedores comerciales de la época era demasiado impuro para su uso. Se necesitaron al menos tres recristalizaciones sucesivas de su BCA sintetizado a partir de agua a 70 °C para purificarlo suficientemente para el ensayo. [ 1 ]

Reactivo B [ 1 ]

Ensayo de micro-BCA (para soluciones diluidas)

El ensayo BCA Micro BCA es un protocolo de 3 componentes que utiliza soluciones concentradas de la reacción de Biuret , BCA y reactivos de cobre(II) . Permite una sensibilidad mejorada de ~2 - 40 μg/mL frente a 20 - 2000  μg/mL del ensayo BCA original. Sin embargo, tiene una interferencia diferente, y en general más sensible, de componentes no proteicos. [ 4 ] Los kits para el ensayo Micro BCA están disponibles en al menos dos proveedores comerciales. [ 9 ] [ 10 ] Cabe destacar que la composición y el uso de un "Reactivo y Protocolo Micro BCA" fueron descritos en el manuscrito original de Smith, [ 1 ] y es probable que los kits modernos consistan en una formulación exacta o muy similar. El protocolo consiste en mezclar el Microreactivo B y la Solución de Cobre en una proporción de 25:1 para formar el Microreactivo C (MC), que no es estable a temperatura ambiente y debe prepararse justo antes de su uso, y luego mezclar MC en una proporción de 1:1 con el Microreactivo A para producir la solución de trabajo final (también inestable) para el ensayo. El Microreactivo A, el Microreactivo B y la Solución de Cobre son estables indefinidamente a temperatura ambiente. [ 1 ]

Microreactivo A (MA) [ 1 ]

Microreactivo B (MB) [ 1 ]

  • 4% p/v BCA-Na 2 (CAS: 979-88-4) (concentración 4 veces mayor que la del reactivo A en el ensayo BCA original anterior )

Solución de cobre [ 1 ]

  • 4% p/v CuSO 4 ·5H 2 O (CAS: 7758-99-8) (Misma concentración que el reactivo B en el ensayo BCA original anterior )

Ensayo de BSA compatible con agentes reductores (RAC)

Este tipo de ensayo BCA incluye un reactivo de compatibilidad de bloqueo covalente de tiol patentado [ 11 ], también conocido como agente de compatibilidad con agentes reductores (RACA) [ 12 ] . Si bien esto permite una mayor compatibilidad con agentes reductores, el ensayo presenta un perfil de interferencia diferente al de otros componentes no proteicos [ 4 ] .

Rapid Gold BCA

Este tipo de ensayo BCA parece estar disponible únicamente en Thermo Fisher Scientific . Según se informa, utiliza "el mismo método de reducción de cobre que el ensayo de proteínas BCA tradicional con un quelante de cobre único [patentado]", que absorbe a 480  nm en lugar de 562  nm. [ 13 ] Este quelante patentado y la supuesta formulación optimizada de la reacción de Biuret permiten que el ensayo proporcione resultados rápidos (<5 min) sin la incubación a 37 °C+ del ensayo BCA original. Sin embargo, el ensayo tiene un perfil de interferencia diferente con otros componentes no proteicos. [ 4 ] El ensayo de péptidos colorimétrico cuantitativo Pierce (ahora propiedad de Thermo Fisher Scientific y disponible en su sitio) parece utilizar un  quelante de cobre patentado similar o idéntico que absorbe a 480 nm. [ 14 ]

Véase también

Referencias

  1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Smith, PK; et al . (1985). "Medición de proteínas mediante ácido bicinchonínico". Anal. Biochem . 150 (1): 76– 85. doi : 10.1016/0003-2697(85)90442-7 . PMID 3843705 .  
  2. ↑ "US4839295A - Medición de proteínas mediante ácido bicinchonínico" . Patentes de Google . 26 de mayo de 1987. Consultado el 9 de abril de 2023 .
  3. ↑ Olsen BJ, Markwell J (2007). "Ensayos para la determinación de la concentración de proteínas" (PDF) . Current Protocols in Protein Science : 14–17 .
  4. 1 2 3 4 Fisher Scientific, Thermo. "Tabla de compatibilidad de ensayos de cuantificación de proteínas" (PDF) . Consultado el 19 de abril de 2023 .
  5. ↑ Kessler, Ralph J.; Fanestil, Darrell D. (1986). "Interferencia de los lípidos en la determinación de proteínas mediante ácido bicinchonínico". Analytical Biochemistry . 159 (1). Elsevier BV: 138– 142. doi : 10.1016/0003-2697(86)90318-0 . ISSN 0003-2697 . PMID 3812993 .  
  6. ↑ Fisher Scientific, Thermo. "Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA - Manual de usuario" (PDF) . Consultado el 22 de abril de 2023 .
  7. ↑ Biosciences, G-. "Ensayo de proteínas con ácido bicinchonínico (BCA) - Manual de usuario" (PDF) . Consultado el 22 de abril de 2023 .
  8. ^ Lesesne, Sherman D.; Henze, Henry R. (1942). "Utilización de alcoxicetonas en la síntesis de quinolinas mediante la reacción de Pfitzinger. II1". Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 64 (8). Sociedad Química Estadounidense (ACS): 1897–1900 . doi : 10.1021/ja01260a041 . ISSN 0002-7863 . 
  9. ↑ Fisher Scientific, Thermo. "Kit de ensayo de proteínas Micro BCA - Instrucciones" (PDF) . Consultado el 22 de abril de 2023 .
  10. ↑ Biosciences, G-. "Ensayo de proteínas con ácido bicinchonínico micro (BCA) - Manual de usuario" (PDF) .
  11. ↑ Fisher Scientific, Thermo. "Kit de ensayo de proteínas BCA-RAC en microplaca Pierce - Manual de usuario" (PDF) . Consultado el 22 de abril de 2023 .
  12. ↑ Biosciences, G-. "Ensayo de proteínas compatible con el agente reductor de ácido bicinchonínico (BCA) - Manual del usuario" (PDF) . Consultado el 22 de abril de 2023 .
  13. ↑ Fisher Scientific, Thermo. "Kit de ensayo de proteínas Pierce Rapid Gold BCA - Guía del usuario" (PDF) . Consultado el 22 de abril de 2023 .
  14. ↑ Fisher Scientific, Thermo. "Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay - User Manual" (PDF) . Thermo Fisher Scientific . Consultado el 19 de julio de 2023 .
  • Wiechelman, K.; Braun, R. y Fitzpatrick, J. (1988). "Investigación del ensayo de proteínas con ácido bicinchonínico: Identificación de los grupos responsables de la formación del color". Anal. Biochem . 175 (1): 231–7 . doi : 10.1016/0003-2697(88)90383-1 . PMID 3245570 . 
  • Stoscheck, CM. (1990). "6". Cuantificación de proteínas . Métodos en enzimología. Vol.  182. pp. 50–69 . doi : 10.1016/0076-6879(90)82008-P . ISBN  9780121820831. PMID 2314256 . 
  • OpenWetWare
  • Química del ensayo BCA