Reconstrucción de la secuencia ancestral

La reconstrucción de secuencias ancestrales ( ASR ), también conocida como reconstrucción / resurrección de genes / secuencias ancestrales , es una técnica utilizada en el estudio de la evolución molecular . El método utiliza secuencias relacionadas para reconstruir un gen "ancestral" a partir de un alineamiento de secuencias múltiples . ^{[ 1 ]}

El método puede utilizarse para «resucitar» proteínas ancestrales y fue propuesto en 1963 por Linus Pauling y Emile Zuckerkandl . ^{[ 2 ]} En el caso de las enzimas, este enfoque se ha denominado paleoenzimología . Algunos esfuerzos iniciales se realizaron en las décadas de 1980 y 1990, liderados por el laboratorio de Steven A. Benner , que demostraron el potencial de esta técnica. ^{[ 3 ]} Gracias a la mejora de los algoritmos y de mejores técnicas de secuenciación y síntesis, el método se desarrolló aún más a principios de la década de 2000 para permitir la resurrección de una mayor variedad de genes, y mucho más antiguos. ^{[ 4 ]} Durante la última década, la resurrección de proteínas ancestrales se ha desarrollado como una estrategia para revelar los mecanismos y la dinámica de la evolución de las proteínas. ^{[ 5 ]}

La ASR se basa en la observación de que las especies estrechamente relacionadas tienen secuencias de ADN similares (véase la Figura 2). Por ejemplo, si dos especies difieren en un nucleótido, como A en humanos y G en chimpancés, podemos asumir con seguridad que un ancestro tenía A o G y que este nucleótido mutó en uno de los linajes ("con seguridad" porque es estadísticamente muy improbable que un nucleótido mute y luego vuelva a mutar). ¿Cómo podemos determinar si el ancestro tenía A o G? ¡Observamos uno o más grupos externos! Si tanto los gorilas como los orangutanes tienen A, podemos asumir con seguridad que este era el nucleótido ancestral y que la mutación A→G ocurrió en el linaje que dio origen a los chimpancés (véanse las Figuras 1 y 2).

Verificación experimental. La mayoría de los estudios ASR se realizan in vitro y han revelado propiedades de proteínas ancestrales que parecen ser rasgos evolutivamente deseables, como una mayor termoestabilidad, actividad catalítica y promiscuidad catalítica. Estos datos se han atribuido a artefactos de los algoritmos ASR, así como a ilustraciones indicativas del entorno de la Tierra antigua; a menudo, la investigación ASR debe complementarse con controles extensos (generalmente experimentos ASR alternativos) para mitigar el error algorítmico. No todas las proteínas ASR estudiadas exhiben esta llamada "superioridad ancestral". ^{[ 6 ]} El campo naciente de la " bioquímica evolutiva " se ha visto reforzado por el reciente aumento de estudios ASR que utilizan los ancestros como formas de investigar la aptitud de los organismos dentro de ciertos contextos celulares, probando efectivamente proteínas ancestrales in vivo . ^{[ 7 ]} Debido a las limitaciones inherentes en este tipo de estudios, principalmente la falta de genomas suficientemente antiguos para encajar estos ancestros, el pequeño repertorio de sistemas modelo de laboratorio bien categorizados y la incapacidad de imitar entornos celulares antiguos; Se han realizado muy pocos estudios de ASR in vivo . A pesar de los obstáculos mencionados anteriormente, las ideas preliminares sobre esta línea de investigación, a partir de un artículo de 2015, han revelado que la "superioridad ancestral" observada in vitro no se recapituló in vivo de una proteína determinada. ^{[ 8 ]} ASR representa uno de los pocos mecanismos para estudiar la bioquímica de la era precámbrica de la vida (>541 Ma ) y, por lo tanto, se usa a menudo en " paleogenética "; de hecho, Zuckerkandl y Pauling originalmente concibieron ASR como el punto de partida de un campo que denominaron "paleobioquímica".

Primero, se alinean varios homólogos relacionados de la proteína de interés en un alineamiento múltiple de secuencias (MSA). Luego, se construye un árbol filogenético con las secuencias inferidas en los nodos de las ramas. Estas secuencias son las denominadas ancestros. Las secuencias ancestrales se calculan típicamente mediante máxima verosimilitud , aunque también se implementan métodos bayesianos . Dado que los ancestros se infieren a partir de una filogenia, la topología y la composición de esta desempeñan un papel fundamental en las secuencias ASR resultantes. Estas secuencias se comparan y, a menudo, se expresan y estudian varias (~10) por nodo filogenético. ASR no pretende recrear la secuencia real de la proteína/ADN ancestral, sino una secuencia que probablemente sea similar a la que se encontraba realmente en el nodo. Esto no se considera una deficiencia de ASR, ya que se ajusta al modelo de " red neutral " de evolución de proteínas, en el que en las uniones evolutivas (nodos) existía una población de secuencias de proteínas genotípicamente diferentes pero fenotípicamente similares en la población de organismos actual. Por lo tanto, es posible que ASR genere una de las secuencias de la red neutral de un nodo y, si bien puede que no represente el genotipo del último ancestro común de las secuencias actuales, es probable que sí represente el fenotipo. ^{[ 7 ]} Esto se ve respaldado por la observación actual de que muchas mutaciones en el sitio no catalítico/funcional de una proteína causan cambios menores en las propiedades biofísicas. Por consiguiente, ASR permite investigar las propiedades biofísicas de proteínas pasadas y es indicativo de genética antigua.

Los métodos de máxima verosimilitud (ML) funcionan generando una secuencia donde se predice que el residuo en cada posición es el más probable de ocupar dicha posición, utilizando una matriz de puntuación (similar a las utilizadas en BLAST o MSA) calculada a partir de secuencias existentes. Los métodos alternativos incluyen la máxima parsimonia (MP), que construye una secuencia basándose en un modelo de evolución de secuencias ; generalmente, la idea de que el número mínimo de cambios de secuencia de nucleótidos representa la ruta más eficiente para que la evolución la siga y, según la navaja de Occam, es la más probable. La MP se considera a menudo el método menos fiable para la reconstrucción, ya que, posiblemente, simplifica demasiado la evolución hasta un grado que no es aplicable a la escala de miles de millones de años.

Los llamados métodos bayesianos se utilizan a veces para complementar los métodos de ML, pero suelen producir secuencias más ambiguas. En ASR, el término "ambigüedad" se refiere a posiciones de residuos donde no se puede predecir una sustitución clara; a menudo, en estos casos, se producen varias secuencias ASR que abarcan la mayoría de las ambigüedades y se comparan entre sí. ML ASR suele necesitar experimentos complementarios para indicar que las secuencias derivadas son más que simples consensos de las secuencias de entrada. Esto es particularmente necesario en la observación de la "superioridad ancestral". ^{[ 9 ]} En la tendencia de aumento de la termoestabilidad, una explicación es que ML ASR crea una secuencia consenso de varios mecanismos paralelos diferentes que evolucionaron para conferir una termoestabilidad proteica menor a lo largo de la filogenia, lo que conduce a un efecto aditivo que resulta en una termoestabilidad ancestral "superior". ^{[ 10 ]}

Validación experimental . La expresión de secuencias de consenso y ASR paralelas mediante métodos no basados ​​en ML a menudo se requieren para desmantelar esta teoría por experimento. Otra preocupación que plantean los métodos de ML es que las matrices de puntuación se derivan de secuencias modernas y las frecuencias de aminoácidos particulares que se ven hoy pueden no ser las mismas que en la biología precámbrica, lo que resulta en una inferencia de secuencia sesgada. Varios estudios han intentado construir matrices de puntuación antiguas mediante diversas metodologías y han comparado las secuencias resultantes y las propiedades biofísicas de sus proteínas. Si bien estas secuencias modificadas dan como resultado secuencias ASR algo diferentes, las propiedades biofísicas observadas no parecieron variar fuera del error experimental. ^{[ 11 ]} Debido a la naturaleza "holística" de ASR y la intensa complejidad que surge cuando se consideran todas las posibles fuentes de error experimental, la comunidad experimental considera que la medida definitiva de la fiabilidad de ASR es la comparación de varias reconstrucciones ASR alternativas del mismo nodo y la identificación de propiedades biofísicas similares. Si bien este método no ofrece una medida estadística y matemática sólida de confiabilidad, se basa en la idea fundamental utilizada en ASR de que las sustituciones individuales de aminoácidos no causan cambios significativos en las propiedades biofísicas de una proteína, un principio que debe cumplirse para poder superar el efecto de la ambigüedad de la inferencia. ^{[ 12 ]}

Los candidatos utilizados para ASR a menudo se seleccionan en función de la propiedad de interés particular que se estudia, por ejemplo, la termoestabilidad . ^{[ 6 ]} Al seleccionar secuencias de cualquiera de los extremos del rango de una propiedad (por ejemplo, proteínas psicrófilas y proteínas termófilas) pero dentro de una familia de proteínas, ASR puede utilizarse para investigar los cambios de secuencia específicos que confirieron el efecto biofísico observado, como las interacciones estabilizadoras. Consideremos en el diagrama que, si la secuencia 'A' codifica una proteína que era óptimamente funcional a pH neutro y la 'D' en condiciones ácidas, los cambios de secuencia entre '5' y '2' pueden ilustrar la explicación biofísica precisa de esta diferencia. Dado que los experimentos de ASR pueden extraer ancestros que probablemente tienen miles de millones de años, a menudo hay decenas, si no cientos, de cambios de secuencia entre los propios ancestros y los ancestros y las secuencias existentes; por ello, estos estudios evolutivos de secuencia-función pueden requerir mucho trabajo y una dirección racional. ^{[ 1 ] [ 13 ] [ 14 ]}

Existen numerosos ejemplos de proteínas ancestrales que han sido reconstruidas computacionalmente, expresadas en líneas celulares vivas y, en muchos casos, purificadas y estudiadas bioquímicamente.

• El laboratorio de Thornton resucitó notablemente varios receptores hormonales ancestrales (de hace aproximadamente 500 millones de años) ^{[ 4 ] [ 15 ] [ 16 ]} y colaboró ​​con el laboratorio de Stevens para resucitar subunidades antiguas de V-ATPasa ^{[ 17 ]} de levadura (800 millones de años).
• El laboratorio de Marqusee ha publicado recientemente varios estudios sobre la historia biofísica evolutiva de la ribonucleasa H1 de E. coli . ^{[ 6 ] [ 18 ]}

Otros ejemplos son los pigmentos visuales ancestrales en vertebrados, ^{[ 19 ]} enzimas en levaduras que descomponen azúcares (800 Ma); ^{[ 20 ]} enzimas en bacterias que proporcionan resistencia a los antibióticos (2 – 3 Ga ); ^{[ 21 ]} las ribonucleasas involucradas en la digestión de rumiantes; las alcohol deshidrogenasas (Adhs) involucradas en la fermentación de levaduras (~85 Ma); ^{[ 12 ]} y RuBisCO en Solanáceas . ^{[ 22 ]}

La "edad" de una secuencia reconstruida se determina utilizando un modelo de reloj molecular , y a menudo se emplean varios. ^{[ 9 ] [ 23 ]} Esta técnica de datación suele calibrarse utilizando puntos de tiempo geológicos (como constituyentes oceánicos antiguos o BIF ) y, si bien estos relojes ofrecen el único método para inferir la edad de una proteína muy antigua , tienen amplios márgenes de error y son difíciles de defender contra datos contrarios. Por ello, la "edad" de ASR debería utilizarse solo como una característica indicativa y a menudo se supera por completo para una medición del número de sustituciones entre las secuencias ancestrales y modernas (el fundamento sobre el que se calcula el reloj). ^{[ 6 ]} Dicho esto, el uso de un reloj permite comparar los datos biofísicos observados de una proteína ASR con el entorno geológico o ecológico de la época. Por ejemplo, los estudios ASR sobre EF-Tus bacterianos (proteínas involucradas en la traducción , que probablemente rara vez están sujetas a HGT y que suelen exhibir Tms ~2C mayor que Tenv) indican una Tierra precámbrica más caliente que coincide muy estrechamente con los datos geológicos sobre las temperaturas oceánicas de la Tierra antigua basados ​​en los niveles isotópicos de oxígeno-18 . ^{[ 11 ]} Los estudios ASR de Adhs de levadura revelan que la aparición de Adhs subfuncionalizadas para el metabolismo del etanol (no solo la excreción de desechos) surgió en un momento similar al inicio de la fruta carnosa en el período Cámbrico y que antes de esta aparición, Adh servía para excretar etanol como subproducto del exceso de piruvato . ^{[ 12 ]} El uso de un reloj también podría indicar que el origen de la vida ocurrió antes de lo que indican los fósiles moleculares más antiguos (>4.1 Ga), pero dada la discutible fiabilidad de los relojes moleculares, tales observaciones deben tomarse con precaución. ^{[ 23 ] [ 24 ]}

Estos experimentos abordan varias preguntas importantes en biología evolutiva: ¿ la evolución procede en pequeños pasos o en grandes saltos?; ¿es reversible la evolución?; ¿cómo evoluciona la complejidad ? Se ha demostrado que pequeñas mutaciones en la secuencia de aminoácidos de los receptores hormonales determinan un cambio importante en sus preferencias por las hormonas. Estos cambios implican grandes avances en la evolución del sistema endocrino . Por lo tanto, cambios muy pequeños a nivel molecular pueden tener consecuencias enormes. El laboratorio de Thornton también ha podido demostrar que la evolución es irreversible estudiando el receptor de glucocorticoides . Este receptor fue modificado por siete mutaciones en un receptor de cortisol, pero revertir estas mutaciones no devolvió el receptor original. Esto indica que la epistasis juega un papel importante en la evolución de las proteínas, una observación que, en combinación con las observaciones de varios ejemplos de evolución paralela, apoya el modelo de red neutral mencionado anteriormente. ^{[ 7 ]} Otras mutaciones neutrales anteriores actuaron como un trinquete e hicieron que los cambios en el receptor fueran irreversibles. ^{[ 26 ]} Estos diferentes experimentos con receptores muestran que, durante su evolución, las proteínas se diferencian enormemente y esto explica cómo puede evolucionar la complejidad. Un análisis más detallado de los distintos receptores hormonales ancestrales y de las diversas hormonas revela que, a nivel de interacción entre residuos de aminoácidos individuales y grupos químicos hormonales, se producen cambios muy pequeños pero específicos. El conocimiento de estos cambios podría, por ejemplo, conducir a la síntesis de equivalentes hormonales capaces de imitar o inhibir la acción de una hormona, lo que abriría nuevas posibilidades terapéuticas.

Dado que la ASR ha revelado una tendencia hacia la termoestabilidad antigua y la promiscuidad enzimática, se presenta como una herramienta valiosa para los ingenieros de proteínas que a menudo buscan estas características (produciendo efectos a veces mayores que las herramientas actuales, dirigidas racionalmente). ^{[ 10 ]} La ASR también promete «resucitar» «organismos antiguos» fenotípicamente similares, lo que a su vez permitiría a los bioquímicos evolutivos investigar la historia de la vida. Los defensores de la ASR, como Benner, afirman que, a través de estos y otros experimentos, a finales del siglo actual se alcanzará un nivel de comprensión en biología análogo al que surgió en la química clásica en el siglo pasado. ^{[ 12 ]}