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Microscopía de excitación de dos fotones

Imágenes volumétricas de calcio de dos fotones de 852 neuronas en el cerebro de un ratón despierto. El volumen de imágenes abarca 1400×1900×460µm³, muestreado a 30 volúmenes por...

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Imágenes volumétricas de calcio de dos fotones de 852 neuronas en el cerebro de un ratón despierto. El volumen de imágenes abarca 1400×1900×460µm³, muestreado a 30 volúmenes por segundo [ 1 ] .
Imágenes volumétricas de dos fotones de microvasos marcados con FITC en el cerebro de ratones despiertos. El volumen de imágenes codificado por color de profundidad abarca 540×550×510µm³, muestreado a 30 volúmenes por segundo [ 1 ] .
Microscopía de excitación de dos fotones del intestino de ratón . Rojo: actina . Verde: núcleos celulares . Azul: moco de las células caliciformes . Obtenida a 780 nm utilizando un láser de titanio-zafiro .

La microscopía de excitación de dos fotones ( TPEF o 2PEF ) es una técnica de imagen por fluorescencia especialmente adecuada para visualizar tejido vivo dispersor de hasta aproximadamente un milímetro de espesor. A diferencia de la microscopía de fluorescencia tradicional , donde la longitud de onda de excitación es menor que la de emisión, la excitación de dos fotones requiere la excitación simultánea mediante dos fotones con una longitud de onda mayor que la de la luz emitida. El láser se enfoca en una ubicación específica del tejido y se desplaza a través de la muestra para generar la imagen secuencialmente. Debido a la no linealidad de la excitación de dos fotones, se excitan principalmente los fluoróforos en el foco micrométrico del haz láser, lo que determina la resolución espacial de la imagen. Esto contrasta con la microscopía confocal , donde la resolución espacial se produce por la interacción del foco de excitación y la detección confinada mediante un orificio.

La microscopía de excitación de dos fotones suele utilizar luz de excitación infrarroja cercana (NIR), que también puede excitar colorantes fluorescentes . El uso de luz infrarroja minimiza la dispersión en el tejido, ya que esta se dispersa menos en los tejidos biológicos típicos. Debido a la absorción multifotónica, la señal de fondo se suprime considerablemente. Ambos efectos dan lugar a una mayor profundidad de penetración para esta técnica. La excitación de dos fotones puede ser una alternativa superior a la microscopía confocal debido a su mayor penetración en el tejido, su eficiente detección de luz y la reducción del fotoblanqueo . [ 2 ] [ 3 ]

Imagen de fluorescencia de dos fotones de una sección transversal teñida de un rizoma de lirio de los valles . La excitación se produce a 840 nm, y los colores rojo y azul representan otros canales de técnicas multifotónicas superpuestas. 

Concepto

Representación esquemática de los niveles de energía (diagramas de Jabłoński) del proceso de fluorescencia, ejemplo de un colorante fluorescente que emite luz a 460 nm. Se absorben uno (púrpura, 1PEF), dos (rojo claro, 2PEF) o tres (rojo oscuro, 3PEF) fotones para emitir un fotón de fluorescencia (turquesa).
Respuesta óptica de una fuente puntual. De izquierda a derecha: distribuciones de intensidad calculadas xy (arriba) y rz (abajo), con escala logarítmica, para una fuente puntual capturada mediante microscopía de campo amplio (a), 2PEF (b) y confocal (c). Las formas 2PEF y confocal tienen una mejor relación señal-ruido que el campo amplio. La distribución 2PEF es mayor debido a que una longitud de onda dos veces mayor que en el caso de un campo amplio o confocal es responsable de la distribución de intensidad. Estas distribuciones de intensidad también se conocen como funciones de dispersión puntual. Condiciones ópticas: las longitudes de onda de excitación son 488 nm y 900 nm respectivamente para 1PEF y 2PEF; la longitud de onda de emisión es 520 nm; la apertura numérica es 1,3 con un objetivo de inmersión en aceite .

La excitación de dos fotones emplea la absorción de dos fotones , un concepto descrito por primera vez por Maria Goeppert Mayer (1906-1972) en su tesis doctoral de 1931, [ 4 ] y observado por primera vez en 1961 en un cristal de CaF₂:Eu²⁺ mediante excitación láser por Wolfgang Kaiser . [ 5 ] Isaac Abella demostró en 1962 en vapor de cesio que la excitación de dos fotones de átomos individuales es posible. [ 6 ]

La microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones presenta similitudes con otras técnicas de microscopía láser confocal, como la microscopía confocal de barrido láser y la microscopía Raman . Estas técnicas utilizan haces láser enfocados que se escanean en un patrón de trama para generar imágenes, y ambas producen un efecto de seccionamiento óptico . A diferencia de los microscopios confocales, los microscopios multifotónicos no contienen las aberturas estenopeicas que les confieren su capacidad de seccionamiento óptico. El seccionamiento óptico producido por los microscopios multifotónicos es resultado de la función de dispersión puntual de la excitación.

El concepto de excitación de dos fotones se basa en la idea de que dos fotones, con una energía considerablemente menor que la necesaria para la excitación de un fotón, también pueden excitar un fluoróforo en un único evento cuántico. Cada fotón transporta aproximadamente la mitad de la energía necesaria para excitar la molécula. El fotón emitido tiene una energía mayor (longitud de onda menor) que cualquiera de los dos fotones excitadores. La probabilidad de absorción casi simultánea de dos fotones es extremadamente baja. Por lo tanto, se suele requerir un flujo máximo elevado de fotones de excitación, generalmente generado por un láser pulsado de femtosegundos . Por ejemplo, la misma potencia media del láser, pero sin pulsación, no produce fluorescencia detectable en comparación con la fluorescencia generada por el láser pulsado mediante el efecto de dos fotones.

Los láseres de excitación de mayor longitud de onda y menor energía (normalmente infrarrojos) de los microscopios multifotónicos son muy adecuados para la obtención de imágenes de células vivas, ya que causan menos daño que los láseres de longitud de onda corta que se utilizan habitualmente para la excitación de un solo fotón, por lo que los tejidos vivos pueden observarse durante períodos más prolongados con menos efectos tóxicos.

Los fluoróforos más utilizados tienen espectros de excitación en el rango de 400 a 500  nm, mientras que el láser utilizado para excitar la fluorescencia de dos fotones se encuentra en el rango de ~700 a 1100  nm (infrarrojo), producido por láseres de titanio-zafiro . Si el fluoróforo absorbe dos fotones infrarrojos simultáneamente, absorberá suficiente energía para pasar al estado excitado. El fluoróforo emitirá entonces un solo fotón con una longitud de onda que depende del tipo de fluoróforo utilizado (típicamente en el espectro visible ). Debido a que se absorben dos fotones durante la excitación del fluoróforo, la probabilidad de emisión fluorescente de los fluoróforos aumenta cuadráticamente con la intensidad de excitación. Por lo tanto, se genera mucha más fluorescencia de dos fotones donde el haz láser está fuertemente enfocado que donde es más difuso. En efecto, la excitación se restringe al pequeño volumen focal (~1 femtolitro), lo que resulta en un alto grado de rechazo de objetos desenfocados. Esta localización de la excitación es la principal ventaja en comparación con los microscopios de excitación de un solo fotón , que requieren el uso de elementos como orificios para rechazar la fluorescencia desenfocada. La fluorescencia de la muestra se recoge mediante un detector de alta sensibilidad, como un tubo fotomultiplicador . Esta intensidad de luz observada se convierte en un píxel de la imagen final; el punto focal se recorre a lo largo de la región deseada de la muestra para formar todos los píxeles de la imagen.

Desarrollo

Diagrama de un microscopio de dos fotones.

La microscopía de dos fotones fue desarrollada y patentada por Winfried Denk y James Strickler en el laboratorio de Watt W. Webb en la Universidad de Cornell en 1990. Combinaron la idea de la absorción de dos fotones con el uso de un escáner láser. [ 2 ] [ 7 ] En la microscopía de excitación de dos fotones, un haz láser infrarrojo se enfoca a través de una lente objetivo. El láser de Ti-zafiro que se usa normalmente tiene un ancho de pulso de aproximadamente 100 femtosegundos (fs) y una frecuencia de repetición de alrededor de 80 MHz , lo que permite la alta densidad y flujo de fotones necesarios para la absorción de dos fotones, y es sintonizable en un amplio rango de longitudes de onda. 

El uso de luz infrarroja para excitar fluoróforos en tejidos dispersores de luz ofrece ventajas adicionales. [ 8 ] Las longitudes de onda más largas se dispersan en menor medida que las más cortas, lo que resulta beneficioso para la obtención de imágenes de alta resolución. Además, es menos probable que estos fotones de menor energía causen daños fuera del volumen focal. En comparación con un microscopio confocal, la detección de fotones es mucho más eficaz, ya que incluso los fotones dispersos contribuyen a la señal útil. Estas ventajas para la obtención de imágenes en tejidos dispersores solo se reconocieron varios años después de la invención de la microscopía de excitación de dos fotones. [ 9 ]

Existen varias limitaciones en el uso de la microscopía de dos fotones: los láseres pulsados ​​necesarios para la excitación de dos fotones son mucho más caros que los láseres de onda continua (CW) utilizados en la microscopía confocal. El espectro de absorción de dos fotones de una molécula puede variar significativamente con respecto a su contraparte de un fotón. El fotodaño de orden superior se convierte en un problema y el blanqueamiento aumenta con el cuadrado de la potencia del láser, mientras que es lineal para la microscopía de un solo fotón (confocal). Para objetos muy delgados, como células aisladas, los microscopios de un solo fotón (confocales) pueden producir imágenes con mayor resolución óptica debido a sus longitudes de onda de excitación más cortas. En cambio, en tejidos dispersores, las capacidades superiores de seccionamiento óptico y detección de luz del microscopio de dos fotones dan como resultado un mejor rendimiento.

Aplicaciones

Principal

La microscopía de dos fotones se ha utilizado en numerosos campos, incluyendo: fisiología, neurobiología, embriología e ingeniería de tejidos . Incluso tejidos delgados, casi transparentes (como las células de la piel), se han visualizado con gran detalle gracias a esta técnica. [ 10 ] Las capacidades de imagen de alta velocidad de la microscopía de dos fotones también se pueden utilizar en la biopsia óptica no invasiva. [ 11 ] La microscopía de dos fotones se ha utilizado de forma apropiada para producir reacciones químicas localizadas, [ 9 ] un efecto que también se ha utilizado para la litografía basada en dos fotones . Utilizando la microscopía basada en fluorescencia de dos fotones y generación de segundo armónico , se demostró que las moléculas orgánicas de tipo porfirina pueden tener diferentes momentos dipolares de transición para la fluorescencia de dos fotones y la generación de segundo armónico, [ 12 ] que de otro modo se pensaba que ocurrían a partir del mismo momento dipolar de transición. [ 13 ] Se demostró que la excitación de dos fotones no degenerativa, o el uso de 2 fotones de longitudes de onda desiguales, aumenta la fluorescencia de todas las moléculas pequeñas y proteínas fluorescentes probadas. [ 14 ]

Investigación del cáncer

También se ha demostrado que 2PEF es muy valioso para caracterizar el cáncer de piel , [ 15 ] También se ha demostrado que revela la detención de células tumorales, la interacción célula tumoral-plaqueta, la interacción célula tumoral-leucocito y los procesos de colonización metastásica. [ 16 ]

Investigación embrionaria

Se ha demostrado que la técnica 2PEF es ventajosa frente a otras técnicas, como la microscopía confocal , en lo que respecta a la obtención de imágenes de células vivas a largo plazo de embriones de mamíferos. [ 17 ]

Investigación renal

2PEF también se ha utilizado en la visualización de tipos de células de difícil acceso, especialmente en lo que respecta a las células renales. [ 18 ] Se ha utilizado para comprender mejor la dinámica de fluidos y la filtración. [ 19 ]

Determinación del nivel de infección viral

También se demostró que 2PEF es una herramienta valiosa para monitorear correlatos de infección viral ( SARS-CoV-2 ) en cultivos celulares utilizando un colorante sensible al Ca 2+ activo en 2P. [ 20 ]

Diagrama de imágenes de la función cerebral in vivo. Muestra el esquema general para la obtención de imágenes, junto con imágenes neuronales y vasculares. Las imágenes se obtuvieron utilizando diversos colorantes fluorescentes.

Neurociencia

La técnica 2PEF, así como su extensión a 3PEF, se utilizan para caracterizar tejidos neuronales intactos en el cerebro de animales vivos e incluso en comportamiento. En particular, el método resulta ventajoso para la obtención de imágenes de calcio de una neurona o poblaciones de neuronas, [ 21 ] para la fotofarmacología, incluyendo la liberación localizada de componentes como el glutamato, [ 22 ] el GABA [ 23 ] o la isomerización de fármacos fotosensibles, [ 24 ] [ 25 ] y para la obtención de imágenes de otros sensores codificados genéticamente que informan sobre la concentración de neurotransmisores. [ 26 ]

Actualmente, la microscopía de dos fotones se utiliza ampliamente para obtener imágenes de la actividad neuronal en vivo en organismos modelo, incluyendo moscas de la fruta ( Drosophila melanogaster ) , ratas , aves canoras , primates , hurones , ratones ( Mus musculus ) y peces cebra . [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] Los animales suelen estar inmovilizados por la cabeza debido al tamaño del microscopio y los dispositivos de escaneo, pero también se están desarrollando microscopios en miniatura que permiten obtener imágenes de neuronas en animales en movimiento y con libre comportamiento. [ 30 ] [ 31 ]

Excitación de orden superior

También es posible la absorción simultánea de tres o más fotones, lo que permite la microscopía de excitación multifotónica de orden superior. [ 32 ] La denominada "microscopía de fluorescencia de excitación de tres fotones" (3PEF) es la técnica más utilizada después de la 2PEF, a la que complementa. También se ha informado de la isomerización localizada de fármacos fotosensibles in vivo mediante excitación de tres fotones. [ 33 ]

Tintes y proteínas fluorescentes para microscopía de excitación de dos fotones

En general, todas las proteínas fluorescentes de uso común (CFP, GFP, YFP, RFP) y los colorantes pueden excitarse mediante excitación de dos fotones. Los espectros de excitación de dos fotones suelen ser considerablemente más amplios, lo que dificulta la excitación selectiva de fluoróforos mediante el cambio de longitudes de onda de excitación.

Se han reportado varios colorantes emisores de luz verde, roja y NIR (sondas y marcadores reactivos) con secciones transversales de absorción de 2 fotones extremadamente altas. [ 34 ] Debido a la estructura de tipo donador-aceptor-donador, los colorantes de escuaraína como Seta-670 , Seta-700 y Seta-660 exhiben eficiencias de absorción de 2 fotones (2PA) muy altas en comparación con otros colorantes, [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] SeTau-647 y SeTau-665 , un nuevo tipo de escuaraína- rotaxano , exhiben secciones transversales de acción de dos fotones extremadamente altas de hasta 10 000 GM en la región del infrarrojo cercano, insuperables por cualquier otra clase de colorantes orgánicos. [ 34 ]

Véase también

Fuentes

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Referencias

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