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Análisis de secuencias

En bioinformática , el análisis de secuencias es el proceso de someter una secuencia de ADN , ARN o péptido a una amplia gama de métodos analíticos para comprender sus caracterí...

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En bioinformática , el análisis de secuencias es el proceso de someter una secuencia de ADN , ARN o péptido a una amplia gama de métodos analíticos para comprender sus características, función, estructura o evolución. Puede realizarse en el genoma, transcriptoma o proteoma completo de un organismo, o bien, en segmentos o regiones seleccionadas, como repeticiones en tándem y elementos transponibles. Entre las metodologías utilizadas se incluyen la alineación de secuencias , las búsquedas en bases de datos biológicas y otras. [ 1 ]

Desde el desarrollo de métodos de producción de alto rendimiento de secuencias de genes y proteínas, la tasa de adición de nuevas secuencias a las bases de datos aumentó muy rápidamente. Esta colección de secuencias, por sí sola, no aumenta la comprensión científica de la biología de los organismos. Sin embargo, comparar estas nuevas secuencias con aquellas de funciones conocidas es una forma clave de comprender la biología del organismo del que proviene la nueva secuencia. Así, el análisis de secuencias se puede utilizar para asignar funciones a las regiones codificantes y no codificantes de una secuencia biológica, generalmente comparando secuencias y estudiando similitudes y diferencias. Hoy en día, existen muchas herramientas y técnicas que permiten realizar comparaciones de secuencias (alineamiento de secuencias) y analizar el producto del alineamiento para comprender su biología. El análisis de secuencias en biología molecular incluye una amplia gama de procesos:

  1. La comparación de secuencias para encontrar similitudes, a menudo para inferir si están relacionadas ( homólogas ).
  2. Identificación de características intrínsecas de la secuencia, como sitios activos , sitios de modificación postraduccional , estructuras genéticas , marcos de lectura , distribución de intrones y exones y elementos reguladores .
  3. Identificación de diferencias y variaciones de secuencia, como mutaciones puntuales y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), para obtener el marcador genético .
  4. Revelando la evolución y la diversidad genética de secuencias y organismos.
  5. Identificación de la estructura molecular a partir únicamente de la secuencia.

Historia

Desde que Fred Sanger caracterizó las primeras secuencias de la proteína insulina en 1951, los biólogos han intentado utilizar este conocimiento para comprender la función de las moléculas. [ 2 ] [ 3 ] Los descubrimientos de él y sus colegas contribuyeron a la secuenciación exitosa del primer genoma basado en ADN. [ 4 ] El método utilizado en este estudio, que se llama "método Sanger" o secuenciación Sanger , fue un hito en la secuenciación de moléculas de cadena larga como el ADN. Este método se utilizó finalmente en el Proyecto Genoma Humano . [ 5 ] Según Michael Levitt , el análisis de secuencias nació en el período de 1969 a 1977. [ 6 ] En 1969, el análisis de secuencias de ARN de transferencia se utilizó para inferir interacciones de residuos a partir de cambios correlacionados en las secuencias de nucleótidos, dando lugar a un modelo de la estructura secundaria del ARNt . [ 7 ] En 1970, Saul B. Needleman y Christian D. Wunsch publicaron el primer algoritmo informático para alinear dos secuencias. [ 8 ] Durante este tiempo, los avances en la obtención de secuencias de nucleótidos mejoraron enormemente, lo que llevó a la publicación del primer genoma completo de un bacteriófago en 1977. [ 9 ] Se cree que Robert Holley y su equipo en la Universidad de Cornell fueron los primeros en secuenciar una molécula de ARN. [ 10 ]

Descripción general del análisis de secuencias de nucleótidos (ADN y ARN)

Los análisis de secuencias de nucleótidos identifican elementos funcionales como los sitios de unión de proteínas, descubren variaciones genéticas como los SNP, estudian los patrones de expresión génica y permiten comprender la base genética de los rasgos. Ayudan a comprender los mecanismos que intervienen en procesos como la replicación y la transcripción. Algunas de las tareas que implica se describen a continuación.

Control de calidad y preprocesamiento

El control de calidad evalúa la calidad de las lecturas de secuenciación obtenidas mediante la tecnología de secuenciación (por ejemplo, Illumina ). Es el primer paso en el análisis de secuencias para limitar conclusiones erróneas debidas a datos de baja calidad. Las herramientas utilizadas en esta etapa dependen de la plataforma de secuenciación. Por ejemplo, FastQC verifica la calidad de las lecturas cortas (incluidas las secuencias de ARN), Nanoplot o PycoQC se utilizan para secuencias de lectura larga (por ejemplo, lecturas de secuencias de Nanopore), y MultiQC agrega el resultado de FastQC en formato de página web. [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]

El control de calidad proporciona información como la longitud de las lecturas, el contenido de GC , la presencia de secuencias adaptadoras (para lecturas cortas) y una puntuación de calidad, que a menudo se expresa en una escala PHRED . [ 14 ] Si hay adaptadores u otros artefactos de la amplificación por PCR en las lecturas (especialmente en las lecturas cortas), se eliminan utilizando software como Trimmomatic [ 15 ] o Cutadapt. [ 16 ]

Alineación de lectura

En este paso, las lecturas de secuenciación cuya calidad se ha mejorado se mapean a un genoma de referencia utilizando herramientas de alineación como BWA [ 17 ] para lecturas cortas de secuencias de ADN, minimap [ 18 ] para lecturas largas de secuencias de ADN y STAR [ 19 ] para lecturas de secuencias de ARN. El propósito del mapeo es encontrar el origen de cualquier lectura dada basándose en la secuencia de referencia. También es importante para detectar variaciones o realizar estudios filogenéticos . El resultado de este paso, es decir, las lecturas alineadas, se almacenan en formatos de archivo compatibles conocidos como SAM, que contienen información sobre el genoma de referencia, así como sobre las lecturas individuales. Alternativamente, se prefieren los formatos de archivo BAM, ya que utilizan mucho menos espacio de escritorio o almacenamiento. [ 14 ]

Nota : Esto es diferente del alineamiento de secuencias, que compara dos o más secuencias completas (o regiones de secuencias) para cuantificar similitudes o diferencias o para identificar una secuencia desconocida (como se explica más adelante).

Los siguientes pasos de análisis son específicos de las secuencias de ADN:

Llamada de variantes

La identificación de variantes es un aspecto popular del análisis de secuencias, ya que estas suelen contener información de importancia biológica, como la explicación del mecanismo de resistencia a fármacos en una enfermedad infecciosa. Estas variantes pueden ser variantes de un solo nucleótido (SNV), pequeñas inserciones/deleciones (indels) y grandes variantes estructurales . Los alineamientos de lecturas se ordenan mediante SAMtools , tras lo cual se utilizan programas de detección de variantes como GATK [ 20 ] para identificar diferencias con respecto a la secuencia de referencia.

La elección de la herramienta de detección de variantes depende en gran medida de la tecnología de secuenciación utilizada, por lo que GATK se usa a menudo cuando se trabaja con lecturas cortas, mientras que las secuencias de lectura larga requieren herramientas como DeepVariant [ 21 ] y Sniffles [ 22 ] . Las herramientas también pueden variar según el organismo (procariotas o eucariotas), la fuente de los datos de secuencia (cáncer frente a metagenómicos ) y el tipo de variante de interés (SNV o variantes estructurales). El resultado de la detección de variantes suele estar en formato VCF y se puede filtrar utilizando frecuencias alélicas, puntuaciones de calidad u otros factores según la pregunta de investigación planteada [ 14 ] .

Anotación de variantes

Este paso añade contexto a los datos de variantes utilizando información seleccionada de artículos revisados ​​por pares y bases de datos públicas como gnomAD y Ensembl . Las variantes se pueden anotar con información sobre características genómicas, consecuencias funcionales, elementos reguladores y frecuencias poblacionales utilizando herramientas como ANNOVAR o SnpEff, [ 23 ] o scripts y flujos de trabajo personalizados. El resultado de este paso es un archivo de anotación en formato bed o txt. [ 14 ]

Visualización e interpretación

Los datos genómicos, como alineamientos de lecturas, gráficos de cobertura y llamadas de variantes, pueden visualizarse mediante navegadores genómicos como IGV (Integrative Genomics Viewer) o UCSC Genome Browser. La interpretación de los resultados se realiza en el contexto de la pregunta biológica o hipótesis en investigación. El resultado puede ser una representación gráfica de los datos en forma de diagramas de Circos, diagramas de volcán, etc., u otros tipos de informes que describan las observaciones. [ 14 ]

El análisis de secuencias de ADN también podría incluir modelos estadísticos para inferir relaciones y análisis epigenéticos, como la identificación de regiones de metilación diferencial utilizando una herramienta como DSS.

Los siguientes pasos son propios de las secuencias de ARN:

Análisis de la expresión génica

Las secuencias de ARN mapeadas se analizan para estimar los niveles de expresión génica utilizando herramientas de cuantificación como HTSeq, [ 24 ] e identificar genes diferencialmente expresados ​​(GDE) entre condiciones experimentales utilizando métodos estadísticos como DESeq2 . [ 25 ] Esto se lleva a cabo para comparar los niveles de expresión de genes o isoformas entre diferentes muestras e inferir relevancia biológica. [ 14 ] El resultado del análisis de expresión génica suele ser una tabla con valores que representan los niveles de expresión de los ID o nombres de los genes en las filas y las muestras en las columnas, así como errores estándar y valores p. Los resultados de la tabla se pueden visualizar aún más utilizando diagramas de volcán y mapas de calor, donde los colores representan el nivel de expresión estimado. Paquetes como ggplot2 en R y Matplotlib en Python se utilizan a menudo para crear las visualizaciones. La tabla también se puede anotar utilizando un archivo de anotación de referencia, generalmente en formato GTF o GFF para proporcionar más contexto sobre los genes, como el nombre del cromosoma, la hebra y las posiciones de inicio y fin, y ayudar a la interpretación de los resultados. [ 14 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 26 ]

Análisis de enriquecimiento funcional

El análisis de enriquecimiento funcional identifica procesos biológicos, vías y efectos funcionales asociados con los genes diferencialmente expresados ​​obtenidos en el paso anterior. Utiliza herramientas como GOSeq [ 27 ] y Pathview [ 28 ] . Esto crea una tabla con información sobre qué vías y procesos moleculares están asociados con los genes diferencialmente expresados, qué genes están regulados a la baja o al alza, y qué términos de ontología génica son recurrentes o están sobrerrepresentados [ 14 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 26 ] .

El análisis de secuencias de ARN explora la dinámica de la expresión génica y los mecanismos reguladores subyacentes a los procesos biológicos y las enfermedades. La interpretación de imágenes y tablas se realiza en el contexto de las hipótesis que se investigan.

Análisis de secuencias de proteínas

El análisis de la secuencia del proteoma estudia el conjunto completo de proteínas expresadas por un organismo o una célula en condiciones específicas. Describe la estructura, la función, las modificaciones postraduccionales y las interacciones de las proteínas dentro de los sistemas biológicos. A menudo, comienza con datos brutos de espectrometría de masas (EM) de experimentos de proteómica, generalmente en formatos de archivo mzML, mzXML o RAW. [ 14 ]

Más allá del preprocesamiento de datos MS brutos para eliminar ruido, normalizar intensidades y detectar picos, y la conversión de formatos de archivo propietarios (p. ej., RAW) a formatos de código abierto (mzML, mzXML) para compatibilidad con herramientas de análisis posteriores, otros pasos analíticos incluyen la identificación de péptidos , la cuantificación de péptidos, la inferencia y cuantificación de proteínas, la generación de informes de control de calidad y la normalización, imputación y pruebas de significancia. La elección y el orden de los pasos analíticos dependen del método MS utilizado, que puede ser adquisición dependiente de datos (DDA) o adquisición independiente (DIA). [ 14 ] [ 29 ]

Navegadores genómicos en el análisis de secuencias

Los navegadores genómicos ofrecen una interfaz intuitiva y sin código para visualizar genomas y segmentos genómicos, identificar características genómicas y analizar la relación entre numerosos elementos genómicos. Los tres principales navegadores genómicos —Ensembl, UCSC y el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI)— admiten diferentes procedimientos de análisis de secuencias, como el ensamblaje y la anotación del genoma, y ​​la genómica comparativa, que permite explorar patrones de expresión diferencial e identificar regiones conservadas. Todos los navegadores admiten múltiples formatos de datos para la carga y descarga, y proporcionan enlaces a herramientas y recursos externos para el análisis de secuencias, lo que contribuye a su versatilidad. [ 30 ] [ 31 ]

Alineación de secuencias

Ejemplo de alineación de secuencias múltiples

Se conocen millones de secuencias de proteínas y nucleótidos . Estas secuencias se agrupan en numerosas secuencias relacionadas, conocidas como familias de proteínas o familias de genes. Las relaciones entre estas secuencias se suelen descubrir alineándolas y asignándoles una puntuación. Existen dos tipos principales de alineación de secuencias: la alineación por pares, que compara solo dos secuencias a la vez, y la alineación múltiple, que compara muchas secuencias. Dos algoritmos importantes para alinear pares de secuencias son el algoritmo de Needleman-Wunsch y el algoritmo de Smith-Waterman . Algunas herramientas populares para la alineación de secuencias son:

Un uso común del alineamiento de secuencias por pares consiste en tomar una secuencia de interés y compararla con todas las secuencias conocidas en una base de datos para identificar secuencias homólogas . En general, las coincidencias en la base de datos se ordenan para mostrar primero las secuencias más relacionadas, seguidas de las secuencias con similitud decreciente. Estas coincidencias suelen reportarse con una medida de significancia estadística, como un valor esperado .

Comparación de perfiles

En 1987, Michael Gribskov, Andrew McLachlan y David Eisenberg introdujeron el método de comparación de perfiles para identificar similitudes distantes entre proteínas. [ 32 ] En lugar de usar una sola secuencia, los métodos de perfil utilizan un alineamiento de secuencias múltiples para codificar un perfil que contiene información sobre el nivel de conservación de cada residuo. Estos perfiles se pueden usar para buscar en colecciones de secuencias para encontrar secuencias relacionadas. Los perfiles también se conocen como Matrices de Puntuación Específicas de Posición (PSSM). En 1993, Anders Krogh y sus colegas introdujeron una interpretación probabilística de los perfiles usando modelos ocultos de Markov . [ 33 ] [ 34 ] Estos modelos se han conocido como HMM de perfil.

En los últimos años se han desarrollado métodos que permiten comparar perfiles directamente entre sí. Estos se conocen como métodos de comparación de perfiles. [ 35 ]

Ensamblaje de secuencias

El ensamblaje de secuencias se refiere a la reconstrucción de una secuencia de ADN mediante la alineación y fusión de pequeños fragmentos de ADN. Es una parte integral de la secuenciación de ADN moderna . Dado que las tecnologías de secuenciación de ADN disponibles actualmente no son adecuadas para leer secuencias largas, las grandes piezas de ADN (como los genomas) a menudo se secuencian (1) cortando el ADN en pequeños fragmentos, (2) leyendo los fragmentos pequeños y (3) reconstituyendo el ADN original mediante la fusión de la información de los distintos fragmentos.

Recientemente, la secuenciación de múltiples especies a la vez es uno de los principales objetivos de investigación. La metagenómica es el estudio de comunidades microbianas obtenidas directamente del medio ambiente. A diferencia de los microorganismos cultivados en el laboratorio, la muestra silvestre suele contener docenas, a veces incluso miles, de tipos de microorganismos de sus hábitats originales. [ 36 ] Recuperar los genomas originales puede resultar muy difícil.

Predicción genética

La predicción o búsqueda de genes se refiere al proceso de identificar las regiones del ADN genómico que codifican genes . Esto incluye genes codificadores de proteínas, así como genes de ARN , pero también puede incluir la predicción de otros elementos funcionales como regiones reguladoras . Geri es uno de los primeros y más importantes pasos para comprender el genoma de una especie una vez que ha sido secuenciado . En general, la predicción de genes bacterianos es significativamente más simple y más precisa que la predicción de genes en especies eucariotas que suelen tener patrones complejos de intrones / exones . Identificar genes en secuencias largas sigue siendo un problema, especialmente cuando se desconoce el número de genes. Los modelos ocultos de Markov pueden ser parte de la solución. [ 37 ] El aprendizaje automático ha jugado un papel significativo en la predicción de la secuencia de factores de transcripción. [ 38 ] El análisis de secuenciación tradicional se centró en los parámetros estadísticos de la propia secuencia de nucleótidos (los programas más comunes utilizados se enumeran en la Tabla 4.1 ). Otro método es identificar secuencias homólogas basándose en otras secuencias genéticas conocidas (herramientas, ver Tabla 4.3 ). [ 36 ] Los dos métodos descritos aquí se centran en la secuencia. Sin embargo, también se ha estudiado la forma de estas moléculas, como el ADN y las proteínas, y se ha propuesto que tiene una influencia equivalente, si no mayor, en el comportamiento de estas moléculas. [ 39 ]

Predicción de la estructura de proteínas

Estructura de la proteína objetivo (3dsm, mostrada en cintas), con esqueletos Cα (en gris) de 354 modelos predichos para ella presentados en el experimento de predicción de estructura CASP8.

Las estructuras tridimensionales de las moléculas son de vital importancia para sus funciones en la naturaleza. Dado que la predicción estructural de moléculas grandes a nivel atómico es un problema prácticamente irresoluble, algunos biólogos introdujeron métodos para predecir la estructura tridimensional a nivel de secuencia primaria. Esto incluye el análisis bioquímico o estadístico de residuos de aminoácidos en regiones específicas y la inferencia estructural a partir de homólogos (u otras proteínas potencialmente relacionadas) con estructuras tridimensionales conocidas.

Se han propuesto numerosos enfoques diversos para resolver el problema de la predicción de estructuras. Para determinar qué métodos eran los más efectivos, se creó una competición de predicción de estructuras denominada CASP (Evaluación Crítica de la Predicción de Estructuras). [ 40 ]

Enfoques y técnicas computacionales

Las tareas de análisis de secuencias suelen ser complejas y requieren el uso de enfoques bastante elaborados, muchos de los cuales constituyen la base de numerosas herramientas de análisis de secuencias existentes. Entre los muchos métodos utilizados en la práctica, los más populares incluyen los siguientes:

Véase también

Referencias

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