Modelos de ratón de metástasis de cáncer de mama

La teoría clásica desarrollada a principios de los 70 anticipó que la metástasis se debe a subpoblaciones genéticamente determinadas en los tumores primarios. ^{[ 2 ]} La varianza genética entre focos metastásicos es significativa solo para un locus particular y dentro de poblaciones celulares específicas o solo una población celular muestra diferencias y algunos loci son divergentes solo en una subpoblación celular. Esto explica el concepto de heterogeneidad tumoral y el orden de los eventos genéticos durante la evolución del tumor . Muchos de los genes que impulsan el crecimiento en el sitio primario pueden determinar la diseminación y colonización en el sitio ectópico . ^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]} El cáncer de mama se considera consensuadamente genética y clínicamente como una enfermedad heterogénea, ya que refleja la heterogeneidad del tejido mamario normal en su origen17873350. ^{[ 6 ]} Una serie de eventos genéticos discretos deben ocurrir para permitir que las células tumorales individuales tengan la capacidad de crecer en un sitio ectópico. La progresión metastásica depende de la regulación de los programas de desarrollo y los eventos ambientales. ^{[ 7 ]} El potencial metastásico de subpoblaciones dentro de las células mamarias de ratón ahora se considera un evento relativamente temprano y la diseminación ocurre al mismo tiempo que las lesiones preinvasivas o microinvasivas. ^{[ 8 ] [ 9 ]} Los perfiles genéticos de las lesiones primarias y metastásicas en carcinomas de mama muestran un alto grado de pertinencia clonal entre las lesiones. ^{[ 10 ] [ 11 ]} Hay varios patrones de prevalencia de mutaciones genéticas en los genomas del tumor mamario primario y sus metástasis. ^{[ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]} También confirma la heterogeneidad genética entre la neoplasia primaria de pacientes con cáncer de mama y sus respectivas metástasis. ^{[ 15 ] [ 16 ]}

Los fenotipos del cáncer de mama expresan periódicamente genes en la metástasis que son indispensables para el proceso metastásico. La diversidad metastásica está mediada por la activación de genes que actúan como acoplamiento al crecimiento específico del órgano. ^{[ 17 ]} El crecimiento de las lesiones en el sitio ectópico depende de múltiples interacciones complejas entre las células metastásicas y los mecanismos homeostáticos del huésped . Las interacciones letales proteína-proteína en el sitio metastásico ayudan a la supervivencia de las células adaptadas . ^{[ 18 ]}

• En 1909, Clarence C. Little desarrolló la primera cepa endogámica , el ratón DBA (diluido, marrón no agutí).
• En 1915, NM Haldane identificó la primera asociación genética en ratones entre ratones albinos y la dilución del color rosado de los ojos en el cromosoma siete.
• En 1921, el ratón C57BL se convirtió en uno de los más utilizados en genética y fue la primera cepa cuyo genoma fue secuenciado .
• En 1982, Palmiter y Brinster implantaron un gen extraño en un óvulo fecundado , generando finalmente los primeros ratones transgénicos modificados genéticamente para expresar oncogenes dominantes. ^{[ 20 ]}
• En 1982, se estimuló la expresión del MMTV-LTR (virus del tumor mamario del ratón-repetición terminal larga) mediante múltiples ciclos de embarazo y lactancia para evaluar la relevancia de un protooncogén celular , c-myc . ^{[ 21 ]}

Los estudios genéticos de enfermedades comunes en humanos sufren limitaciones significativas por razones prácticas y éticas . ^{[ 22 ]} Se pueden usar líneas celulares humanas para modelar enfermedades, pero es difícil estudiar procesos a nivel tisular , dentro de un órgano o en todo el cuerpo. Los ratones pueden ser una buena representación de enfermedades en humanos porque: ^{[ 23 ]}

• Existen grandes similitudes en cuanto a fisiología , desarrollo y biología celular entre ratones y humanos.
• Tanto los humanos como los ratones poseen alrededor de 30.000 genes codificadores de proteínas. El número de genes de ratón sin un homólogo humano correspondiente es inferior al 1%.
• El 90% de los genomas humanos y de ratón son sinténicos .
• El 40% de los genomas humanos y de ratón pueden alinearse a nivel de nucleótidos .
• Los ratones tienen periodos de gestación relativamente cortos .
• Los ratones tardan poco tiempo en alcanzar la madurez sexual .
• Los ratones tienen camadas numerosas.
• La disponibilidad de cientos de mutaciones que afectan a casi todos los tejidos y aspectos del desarrollo.

Los ratones podrían no ser un modelo ideal para el cáncer de mama. Esto se debe principalmente a la falta de precisión de muchos de los modelos. Al estudiar la metástasis, es difícil determinar la ubicación precisa, así como su frecuencia. Otro problema radica en los subtipos epiteliales y la imposibilidad de dirigirlos específicamente al atacar una mutación. Un ejemplo de esto sería determinar el desarrollo de tumores en ratones K14-Cre BRCA2. En un caso estándar, la escisión de BRCA2 no produjo tumorigénesis, pero si p53 estaba mutado e inactivado, sí se produciría tumorigénesis. Por lo tanto, no existe una respuesta definitiva en cuanto al origen del tumor, debido a la mutación adicional en p53. ^{[ 24 ]}

Varias líneas celulares de carcinoma mamario de ratón, como 4T1 ^{[ 25 ]} y TS/A , son metastásicas en ratones inmunocompetentes singénicos y pueden usarse para identificar genes y vías involucradas en el proceso metastásico. ^{[ 26 ]}

El trasplante de células tumorales en ratones inmunodeficientes es una herramienta para estudiar el cáncer de mama y sus efectos metastásicos. El trasplante se realiza mediante alotrasplantes o trasplantes xenogénicos . ^{[ 27 ]} Comúnmente, se inoculan células humanas en un receptor murino inmunocomprometido . La inoculación de células se realiza mediante trasplantes intraductales, ^{[ 28 ]} mediante inyecciones en la almohadilla grasa mamaria despejada ^{[ 29 ] [ 30 ]} o mediante trasplantes en la vena de la cola. ^{[ 31 ] [ 32 ] [ 33 ]} Se pueden sembrar diferentes órganos con células de cáncer de mama dependiendo de la vía de inyección. ^{[ 34 ]}

• Inyección cardíaca: Hueso
• Inyección en la vena de la cola: Pulmón
• Inyección esplénica: Hígado
• Inyección en la arteria carótida: Cerebro

Los ratones inmunodeficientes específicos que se utilizaron fueron los ratones NOD/SCID (diabéticos no obesos/inmunodeficientes condicionales graves). Estas mutaciones permiten la integración de nuevos tejidos de xenoinjerto. Primero, se deben humanizar las almohadillas de grasa mamaria del ratón mediante la inyección de fibroblastos estromales mamarios humanos inmortalizados con telemorasa humana (fibroblastos RMF/EG) en dichas almohadillas. Sin esta inyección, las células epiteliales mamarias humanas injertadas en la almohadilla no pueden colonizar ni crecer. Posteriormente, los fibroblastos RMF/EG deben irradiarse para permitir la expresión de proteínas y factores de crecimiento clave. Tras cuatro semanas de desarrollo, las células epiteliales mamarias humanas recién injertadas se expandieron dentro de la almohadilla de grasa. ^{[ 35 ]}

Los ratones modificados genéticamente se construyen para modelar fenotipos y patologías humanas . Los ratones mutantes pueden incluir transgenes mediante diferentes métodos de administración:

• El uso de un sistema inducible por tetraciclina derivado de bacterias que permite la activación o desactivación (sistema Tet-On/Tet-Off) ^{[ 36 ]}
• Mutaciones dirigidas mediante la inserción de genes y la eliminación de secuencias mediante el uso del sistema de recombinación Cre-Lox ^{[ 37 ].}
• Introducción de mutaciones retrovirales ^{[ 38 ]}
• Introducción de mutaciones inducidas químicamente

Modelos de ratones transgénicos de cáncer de mama

Los ratones sometidos al proceso de transgénesis se conocen como ratones transgénicos. Un transgén básico tiene una región promotora , una secuencia codificante de proteínas, un intrón y un codón de parada . El virus del tumor mamario del ratón (MMTV) es un retrovirus que se ha demostrado que promueve la aparición de tumores mamarios una vez activado. ^{[ 39 ]} El MMTV es un mutágeno somático hereditario cuyo rango de acción es limitado. Contiene una secuencia de ADN reguladora llamada repetición terminal larga (LTR), que promueve la transcripción inducible por hormonas esteroides. ^{[ 40 ] [ 41 ]} La tumorigénesis inducida por el virus del tumor mamario del ratón también puede producirse por la integración del genoma viral. Se sabe que los sitios de integración son genes críticos para la regulación celular. ^{[ 42 ]} La proteína ácida del suero (WAP) ^{[ 43 ]} es otro promotor común utilizado para generar modelos de cáncer de mama en ratones. Para obtener una lista de otros promotores específicos de la glándula mamaria y modelos de ratón, consulte ^{[ 44 ] .}

Al insertar o inactivar genes específicos mediante recombinación homóloga, se puede medir el grado de metástasis y lograr la identificación de nuevos genes diana; por ejemplo, un gen que regula de forma consistente el comportamiento metastásico de las células cancerosas es TGF-β1. La ablación aguda de la señalización de TGF-β en células de tumores mamarios MMTV-PyMT conduce a un aumento de cinco veces en la metástasis pulmonar. ^{[ 64 ]} Ciertas regiones potenciadoras también pueden analizarse y determinarse como una parte crucial de la proliferación celular; por ejemplo, una región potenciadora asociada con el gen crítico del cáncer p53, que se determinó mediante CRISPR-Cas9. ^{[ 65 ]}

Las estrategias cuantitativas de rastreo de linaje han demostrado ser exitosas en la resolución de destinos celulares en tejidos epiteliales normales ya sea utilizando transgenes específicos de tejido o específicos de células madre . Para realizar un experimento de rastreo de linaje inducible, se deben diseñar dos componentes en el genoma del ratón: un interruptor y un reportero. El interruptor es comúnmente una forma regulada por fármacos de la enzima bacteriana Cre-recombinasa. Esta enzima reconoce secuencias específicas, llamadas sitios LoxP. ^{[ 66 ]} Las proteínas que son capaces de mejorar la identificación de células marcadas o una población específica en células no marcadas están codificadas por los transgenes reporteros. Después de extraer las diez glándulas mamarias de los ratones transgénicos, generalmente se hace una suspensión de células individuales y se trasplanta ya sea en la vena de la cola de ratones receptores no transgénicos ^{[ 31 ]} o en la almohadilla de grasa despejada de ratones no transgénicos repoblando la almohadilla de grasa mamaria. ^{[ 67 ]} Estas células luego se siguen en el torrente sanguíneo, los pulmones, la médula ósea y el hígado para buscar el sitio favorable de metástasis. Estas células transgénicas se pueden rastrear de acuerdo con sus características especiales de fluorescencia o inducidas al colocar a los receptores en alimentos con doxiciclina.

Otra herramienta para estudiar la metástasis del cáncer de mama es buscar células tumorales circulantes en ratones transgénicos; por ejemplo, los ratones MMTV-PyMT pueden responder a diversas terapias liberando células tumorales en la sangre, lo que conduce a metástasis pulmonares. ^{[ 68 ]} No solo en la sangre, sino que también se pueden detectar células en la médula ósea; por ejemplo, se identificaron células positivas para citoqueratina en la médula ósea de ratones transgénicos MMTV-pyMT y MMTV-Neu, pero no en los controles de tipo silvestre. ^{[ 69 ]}

Ante la ausencia de marcadores específicos para las células mamarias, los modelos con marcaje genético de las células tumorales ofrecen la mejor ventaja experimental; sin embargo, el bajo volumen de sangre periférica que se puede obtener de animales vivos limita la aplicación de esta técnica.

La obtención de imágenes de bioluminiscencia se basa en la detección de la luz producida por la oxidación enzimática de un sustrato exógeno. El sustrato luciferina se oxida a oxiluciferina en presencia de luciferasa y emite luz, que puede detectarse utilizando un sistema IVIS como una máquina Xenogen. Las células mamarias disociadas de animales MMTV-PyMT: IRES: Luc; MTB ( sitio de entrada interna del ribosoma : Luciferina ) (que no fueron expuestos a doxiciclina) pueden inyectarse en las venas laterales de la cola de ratones inmunodeficientes con una dieta libre de doxiciclina. No se observará ninguna señal de bioluminiscencia en los pulmones de los ratones receptores hasta que se les administre alimento con doxiciclina. La bioluminiscencia puede detectarse entonces en el tórax dentro de las 2 semanas del inicio de la exposición a la doxiciclina. ^{[ 31 ]} La luciferasa se inyecta justo antes de tomar las imágenes.

La microscopía intravital con excitación multifotónica es una técnica para visualizar células modificadas genéticamente directamente in vivo. Las cascadas metastásicas de múltiples pasos pueden visualizarse mediante el marcaje con un color fluorescente único bajo un microscopio de fluorescencia . ^{[ 70 ] [ 71 ]}

La tomografía por emisión de positrones (PET), la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y la tomografía computarizada (TC) se han utilizado para comparar la eficiencia de estas imágenes in vivo para detectar lesiones en una etapa temprana y para evaluar la respuesta a la quimioterapia. ^{[ 72 ]}

La resonancia magnética requiere el uso de nanopartículas (liposomas) y un agente de contraste para resonancia magnética llamado gadolinio. Las partículas se colocaron en vesículas mediante un filtro de membrana de policarbonato. Las nanopartículas se inyectaron en ratones con metástasis y se dejaron allí durante veinticuatro horas. Posteriormente, se realizó una resonancia magnética a estos ratones y, mediante el software de imagen, se observaron acumulaciones de estas partículas en ciertas áreas donde las células habían metastatizado. ^{[ 22 ]}