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Tipificación de secuencias multilocus

La tipificación de secuencias multilocus ( MLST ) es una técnica de biología molecular que utiliza secuencias de ADN de fragmentos internos de múltiples genes constitutivos para...

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La tipificación de secuencias multilocus ( MLST ) es una técnica de biología molecular que utiliza secuencias de ADN de fragmentos internos de múltiples genes constitutivos para caracterizar aislamientos de diferentes especies. Se aplica con mayor frecuencia a microorganismos , principalmente procariotas y levaduras, ya que suelen ser difíciles de diferenciar mediante otros métodos.

El primer esquema MLST desarrollado fue para Neisseria meningitidis , [ 1 ] el agente causal de la meningitis meningocócica y la septicemia . Desde su introducción para la investigación de la historia evolutiva, el MLST se ha utilizado no solo para patógenos humanos sino también para patógenos vegetales. [ 2 ]

Principio

La tipificación multilocus de secuencias (MLST) mide directamente las variaciones en la secuencia de ADN de un conjunto de genes constitutivos y caracteriza las cepas por sus perfiles alélicos únicos. El principio de la MLST es sencillo: la técnica consiste en la amplificación por PCR seguida de la secuenciación del ADN . Las diferencias de nucleótidos entre cepas pueden analizarse en un número variable de genes, según el grado de discriminación deseado.

El flujo de trabajo de MLST comprende: 1) recopilación de datos, 2) análisis de datos y 3) análisis de secuencias multilocus . En la etapa de recopilación de datos, se obtiene la identificación definitiva de la variación mediante la determinación de la secuencia de nucleótidos de fragmentos de genes. En la etapa de análisis de datos, a todas las secuencias únicas se les asignan números de alelo y se combinan en un perfil alélico, al que se le asigna un tipo de secuencia (ST). Si se encuentran nuevos alelos y ST, se almacenan en la base de datos después de su verificación. En la etapa final de análisis de MLST, se determina el parentesco entre los aislados comparando los perfiles alélicos. Los investigadores realizan estudios epidemiológicos y filogenéticos comparando los ST de diferentes complejos clonales. Durante el proceso de secuenciación e identificación se genera un gran conjunto de datos, por lo que se utilizan técnicas bioinformáticas para organizar, gestionar, analizar y fusionar todos los datos biológicos.

Para lograr un equilibrio entre la capacidad de identificación aceptable, el tiempo y el costo de la tipificación de cepas, en los laboratorios se suelen utilizar entre siete y ocho genes de referencia. Tomando como ejemplo Staphylococcus aureus , se utilizan siete genes de referencia en la tipificación MLST. Estos genes incluyen la carbamato quinasa ( arcC ), la shikimato deshidrogenasa ( aroE ), la glicerol quinasa ( glpF ), la guanilato quinasa ( gmk ), la fosfato acetiltransferasa ( pta ), la triosafosfato isomerasa ( tpi ) y la acetil coenzima A acetiltransferasa ( yqiL ), según lo especificado en el sitio web de MLST. Sin embargo, no es raro que se utilicen hasta diez genes de referencia. Para Vibrio vulnificus , los genes constitutivos utilizados son la glucosa-6-fosfato isomerasa ( glp ), la ADN girasa, subunidad B ( gyrB ), la malato-lactato deshidrogenasa ( mdh ), la metionil-ARNt sintetasa ( metG ), la fosforribosilaminoimidazol sintetasa ( purM ), la treonina deshidrogenasa ( dtdS ), la diaminopimelato descarboxilasa ( lysA ), la transhidrogenasa subunidad alfa ( pntA ), la dihidroorotasa ( pyrC ) y la triptofanasa ( tnaA ). Por lo tanto, tanto el número como el tipo de genes constitutivos analizados mediante MLST pueden variar de una especie a otra.

Para cada uno de estos genes constitutivos, las diferentes secuencias se asignan como alelos, y los alelos en los loci proporcionan un perfil alélico. Una serie de perfiles puede servir como marcador de identificación para la tipificación de cepas. Las secuencias que difieren incluso en un solo nucleótido se asignan como alelos diferentes, y no se aplica ninguna ponderación para tener en cuenta el número de diferencias de nucleótidos entre alelos, ya que no podemos distinguir si las diferencias en múltiples sitios de nucleótidos son el resultado de múltiples mutaciones puntuales o de un único intercambio recombinacional. El gran número de alelos potenciales en cada locus permite distinguir miles de millones de perfiles alélicos diferentes, y se esperaría que una cepa con el alelo más común en cada locus solo ocurriera por casualidad aproximadamente una vez cada 10 000 aislamientos. A pesar de que el MLST proporciona un alto poder discriminatorio, la acumulación de cambios de nucleótidos en los genes constitutivos es un proceso relativamente lento, y el perfil alélico de un aislamiento bacteriano es suficientemente estable en el tiempo como para que el método sea ideal para la epidemiología global.

El parentesco entre los aislados se muestra como un dendrograma construido utilizando la matriz de diferencias por pares entre sus perfiles alélicos, eBURST o un árbol de expansión mínima (MST). El dendrograma es solo una forma conveniente de mostrar aquellos aislados que tienen perfiles alélicos idénticos o muy similares que se pueden asumir derivados de un ancestro común; las relaciones entre aislados que difieren en más de tres de los siete loci probablemente no sean confiables y no deben usarse para inferir su filogenia. [ 3 ] [ 4 ] El MST conecta todas las muestras de tal manera que la distancia sumada de todas las ramas del árbol es mínima. [ 5 ]

Alternativamente, también se puede analizar el parentesco de los aislados conAnálisis de secuencias multilocus ( MLSA ). Este método no utiliza los alelos asignados, sino que concatena las secuencias de los fragmentos génicos de los genes constitutivos y utiliza esta secuencia concatenada para determinar las relaciones filogenéticas. A diferencia del MLST, este análisis asigna una mayor similitud entre secuencias que difieren en un solo nucleótido y una menor similitud entre secuencias con múltiples diferencias de nucleótidos. Como resultado, este análisis es más adecuado para organismos con evolución clonal y menos adecuado para organismos en los que ocurren eventos de recombinación con mucha frecuencia. También puede utilizarse para determinar las relaciones filogenéticas entre especies estrechamente relacionadas. [ 6 ] Los términos MLST y MLSA se consideran a menudo intercambiables. Sin embargo, esto no es correcto, ya que cada método de análisis tiene sus características y usos distintivos. Debe tenerse cuidado al utilizar el término correcto.

Comparación con otras técnicas

Anteriormente se habían establecido métodos de tipificación serológica para diferenciar aislamientos bacterianos, pero la tipificación inmunológica presenta inconvenientes como la dependencia de pocos loci antigénicos y la reactividad impredecible de los anticuerpos con diferentes variantes antigénicas. Se han propuesto varios esquemas de tipificación molecular para determinar la relación entre patógenos, como la electroforesis en gel de campo pulsado ( PFGE ), el ribotipado y la huella genética basada en PCR . Sin embargo, estos métodos de subtipificación basados ​​en bandas de ADN no proporcionan análisis evolutivos significativos. A pesar de que muchos investigadores consideran la PFGE como el método de referencia, muchas cepas no pueden tipificarse mediante esta técnica debido a la degradación del ADN durante el proceso (manchas en el gel).

El enfoque de MLST es distinto de la electroforesis enzimática multilocus (MLEE), que se basa en las diferentes movilidades electroforéticas (EM) de múltiples enzimas metabólicas centrales. Los alelos en cada locus definen la EM de sus productos, ya que las diferentes secuencias de aminoácidos entre las enzimas dan como resultado diferentes movilidades y bandas distintas cuando se analizan en un gel. El parentesco de los aislados se puede visualizar con un dendrograma generado a partir de la matriz de diferencias por pares entre los tipos electroforéticos. Este método tiene una resolución menor que MLST por varias razones, todas derivadas del hecho de que la diversidad del fenotipo enzimático es simplemente un indicador de la diversidad de la secuencia de ADN. Primero, las enzimas pueden tener diferentes secuencias de aminoácidos sin tener una EM suficientemente diferente como para dar bandas distintas. Segundo, las "mutaciones silenciosas" pueden alterar la secuencia de ADN de un gen sin alterar los aminoácidos codificados. En tercer lugar, el fenotipo de la enzima puede alterarse fácilmente en respuesta a las condiciones ambientales y afectar negativamente la reproducibilidad de los resultados de MLEE. Las modificaciones comunes de las enzimas incluyen la fosforilación, la unión de cofactores y la escisión de secuencias de transporte. Esto también limita la comparabilidad de los datos de MLEE obtenidos por diferentes laboratorios, mientras que MLST proporciona datos de secuencias de ADN portátiles y comparables, y tiene un gran potencial para la automatización y la estandarización.

MLST es similar a la codificación de barras de ADN en que ambas intentan utilizar información genética parcial para diferenciar entre poblaciones de organismos. Sin embargo, la codificación de barras de ADN tiene como objetivo diferenciar entre especies y prefiere el uso de uno o dos fragmentos cortos con tasas de mutación relativamente rápidas (por ejemplo, fragmentos de ADNmt o ADNr), que normalmente generan una variación significativa en las secuencias entre especies. Cuando esto no es posible, se pueden utilizar múltiples loci, [ 7 ] aunque, a diferencia de MLST, el enfoque sigue estando en el nivel de especie. [ 8 ]

Ventajas y aplicaciones

MLST es altamente inequívoco y portátil. Los materiales necesarios para la determinación del tipo de secuencia (ST) pueden intercambiarse entre laboratorios. Las secuencias de los cebadores y los protocolos están disponibles electrónicamente. Es reproducible y escalable. MLST es un método automatizado que combina los avances en secuenciación de alto rendimiento y bioinformática con técnicas de genética de poblaciones ya establecidas. Los datos de MLST pueden utilizarse para investigar las relaciones evolutivas entre bacterias. MLST ofrece una buena capacidad discriminatoria para diferenciar aislamientos.

La aplicación de MLST es muy amplia y constituye un recurso valioso para las comunidades científicas, de salud pública y veterinarias, así como para la industria alimentaria. A continuación, se presentan algunos ejemplos de aplicaciones de MLST.

Campylobacter

Campylobacter es el agente causal común de enfermedades infecciosas intestinales bacterianas, generalmente derivadas de aves de corral poco cocidas o leche sin pasteurizar. Sin embargo, su epidemiología es poco conocida, ya que los brotes rara vez se detectan, por lo que las fuentes y las vías de transmisión no se pueden rastrear fácilmente. Además, los genomas de Campylobacter son genéticamente diversos e inestables, con frecuentes recombinaciones inter e intragenómicas, junto con variación de fase, lo que complica la interpretación de los datos de muchos métodos de tipificación. Hasta hace poco, con la aplicación de la técnica MLST, la tipificación de Campylobacter ha logrado un gran éxito y se ha ampliado la base de datos MLST. A fecha de 1 de mayo de 2008, la base de datos MLST de Campylobacter contiene 3516 aislamientos y alrededor de 30 publicaciones que utilizan o mencionan MLST en investigaciones sobre Campylobacter ( http://pubmlst.org/campylobacter/ ).

Neisseria meningitidis

MLST ha proporcionado una imagen más rica y detallada de las bacterias dentro de las poblaciones humanas y en variantes de cepas que pueden ser patógenas para humanos, plantas y animales. La técnica MLST fue utilizada por primera vez por Maiden et al. (1) para caracterizar Neisseria meningitidis usando seis loci. La aplicación de MLST ha resuelto claramente los principales linajes meningocócicos conocidos responsables de la enfermedad invasiva en todo el mundo. Para mejorar el nivel de poder discriminatorio entre los principales linajes invasivos, ahora se están utilizando siete loci y han sido aceptados por muchos laboratorios como el método de elección para caracterizar aislamientos meningocócicos. Es un hecho bien conocido [ 9 ] que los intercambios recombinacionales ocurren comúnmente en N. meningitidis , lo que lleva a una rápida diversificación de clones meningocócicos. MLST ha proporcionado con éxito un método confiable para la caracterización de clones dentro de otras especies bacterianas en las que las tasas de diversificación clonal son generalmente más bajas.

Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus causa diversas enfermedades. El Staphylococcus aureus resistente a la meticilina ( SARM ) ha generado creciente preocupación debido a su resistencia a casi todos los antibióticos, excepto la vancomicina. Sin embargo, la mayoría de las infecciones graves por S. aureus en la comunidad, y muchas en hospitales, son causadas por cepas sensibles a la meticilina (MSSA), y se han realizado pocos intentos para identificar los clones hipervirulentos de MSSA asociados con enfermedades graves. Por lo tanto, se desarrolló la tipificación multilocus de secuencias (MLST) para proporcionar un método inequívoco de caracterización de clones de SARM y para la identificación de los clones de MSSA asociados con enfermedades graves.

Streptococcus pyogenes

Streptococcus pyogenes causa enfermedades que van desde faringitis hasta impétigo potencialmente mortal, incluyendo fascitis necrosante. Se ha desarrollado un esquema MLST para S. pyogenes . Actualmente, la base de datos ( mlst.net ) [ 10 ] contiene los perfiles alélicos de aislamientos que representan la diversidad mundial del organismo y aislamientos de enfermedades invasivas graves. [ 11 ]

Candida albicans

Candida albicans es un hongo patógeno humano responsable de infecciones del torrente sanguíneo adquiridas en hospitales. La técnica MLST se utiliza para caracterizar aislamientos de C. albicans . La combinación de alelos en diferentes loci genera secuencias diploides únicas que permiten diferenciar cepas. Se ha demostrado que la técnica MLST es eficaz para estudiar la epidemiología de C. albicans en hospitales, así como la diversidad de aislamientos de C. albicans obtenidos de diversos nichos ecológicos, incluyendo huéspedes humanos y animales.

Cronobacter

El género Cronobacter está compuesto por 7 especies. Antes de 2007, el nombre de especie única Enterobacter sakazakii se aplicaba a estos organismos. El MLST de Cronobacter se aplicó inicialmente para distinguir entre C. sakazakii y C. malonaticus porque la secuenciación del ADNr 16S no siempre es suficientemente precisa y la biotipificación es demasiado subjetiva. [ 12 ] El esquema MLST de Cronobacter utiliza 7 alelos; atpD , fusA , glnS , gltB , gyrB , infB y ppsA dan una secuencia concatenada de 3036 pb para análisis filogenético (MLSA) y genómica comparativa . [ 13 ] El MLST también se ha utilizado en el reconocimiento formal de nuevas especies de Cronobacter . [ 14 ] El método ha revelado una fuerte asociación entre un linaje genético, el tipo de secuencia 4 (ST4), y casos de meningitis neonatal., [ 15 ] El sitio MLST de Cronobacter se encuentra en http://www.pubMLST.org/cronobacter .

Limitaciones

MLST parece ser la mejor opción en estudios de genética de poblaciones, pero es costosa. Debido a la conservación de la secuencia en los genes constitutivos, MLST a veces carece del poder discriminatorio para diferenciar cepas bacterianas, lo que limita su uso en investigaciones epidemiológicas. Para mejorar el poder discriminatorio de MLST, se ha desarrollado un enfoque de tipificación de secuencias de múltiples loci de virulencia (MVLST) utilizando Listeria monocytogenes . [ 16 ] MVLST amplía los beneficios de MLST, pero se dirige a genes de virulencia, que pueden ser más polimórficos que los genes constitutivos. La genética de poblaciones no es el único factor relevante en una epidemia. Los factores de virulencia también son importantes en la causación de enfermedades, y los estudios de genética de poblaciones tienen dificultades para monitorearlos. Esto se debe a que los genes involucrados a menudo se recombinan y son móviles entre cepas en comparación con el marco de la genética de poblaciones. Así, por ejemplo, en Escherichia coli , identificar cepas portadoras de genes de toxinas es más importante que tener una evaluación de cepas prevalentes basada en la genética de poblaciones.

La llegada de las tecnologías de secuenciación de segunda generación ha permitido obtener información de secuencia de todo el genoma bacteriano con un coste y esfuerzo relativamente modestos, y ahora se puede asignar MLST a partir de la información de la secuencia del genoma completo, en lugar de secuenciar cada locus por separado como se hacía cuando se desarrolló MLST por primera vez. [ 17 ] La secuenciación del genoma completo proporciona información más rica para diferenciar cepas bacterianas (MLST utiliza aproximadamente el 0,1 % de la secuencia genómica para asignar el tipo, ignorando el resto del genoma bacteriano). Por ejemplo, la secuenciación del genoma completo de numerosos aislados ha revelado que el único linaje MLST ST258 de Klebsiella pneumoniae comprende dos clados genéticos distintos, [ 18 ] proporcionando información adicional sobre la evolución y propagación de estos organismos multirresistentes a los fármacos, y refutando la hipótesis anterior de un único origen clonal para ST258. [ 19 ]

Bases de datos

Las bases de datos MLST contienen las secuencias de alelos de referencia y los tipos de secuencia para cada organismo, además de datos epidemiológicos aislados. Los sitios web incluyen software de consulta y análisis que permite a los usuarios buscar sus secuencias de alelos y tipos de secuencia. MLST es una herramienta ampliamente utilizada por investigadores y profesionales de la salud pública.

La mayoría de las bases de datos MLST están alojadas en un servidor web ubicado actualmente en la Universidad de Oxford ( pubmlst.org ).

La base de datos alojada en el sitio contiene las secuencias de alelos de referencia específicas de cada organismo y listas de ST para organismos individuales.

Para facilitar la recopilación y el formato de las secuencias utilizadas, se ha desarrollado un complemento sencillo y gratuito para Firefox ( enlace archivado el 22/02/2014 en Wayback Machine ).

Referencias

  1. ↑ Maiden, MC.; Bygraves, JA.; Feil, E.; Morelli, G.; Russell, JE.; Urwin, R.; Zhang, Q.; Zhou, J.; et  al. (marzo de 1998). "Tipificación de secuencias multilocus: un enfoque portátil para la identificación de clones dentro de poblaciones de microorganismos patógenos" . Proc Natl Acad Sci USA . 95 (6): 3140– 5. Bibcode : 1998PNAS...95.3140M . doi : 10.1073/pnas.95.6.3140 . PMC 19708. PMID 9501229 .  
  2. ↑ Sarris, PF; Trantas, EA; Mpalantinaki, E; Ververidis, F; Goumas, DE (2012). " Pseudomonas viridiflava , un patógeno vegetal de múltiples huéspedes con variación genética significativa a nivel molecular" . PLOS ONE . 7 (4) e36090. Bibcode : 2012PLoSO...736090S . doi : 10.1371/journal.pone.0036090 . PMC 3338640. PMID 22558343 .  
  3. ↑ Spratt, Brian G (1999). "Tipificación de secuencias multilocus: tipificación molecular de patógenos bacterianos en una era de secuenciación rápida de ADN e Internet". Current Opinion in Microbiology . 2 (3): 312– 316. Bibcode : 1999COMb....2..312S . doi : 10.1016/S1369-5274(99)80054-X . PMID 10383857 . 
  4. ↑ Spratt, BG; Maiden, MC (1999). "Genética de poblaciones bacterianas, evolución y epidemiología" . Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci . 354 (1384): 701– 710. doi : 10.1098/rstb.1999.0423 . PMC 1692550. PMID 10365396 .  
  5. ↑ Jolley, Keith. "Minimum Spanning Tree" . pubMLST. Archivado del original el 15 de septiembre de 2007. Recuperado el 10 de octubre de 2013 .
  6. ^ Gevers D, Cohan FM, Lawrence JG, Spratt BG, Coenye T, Feil EJ, Stackebrandt E, Van de Peer Y, Vandamme P, Thompson FL, Swings J (2005). "Opinión: Reevaluación de especies procarióticas". Nat Rev Microbiol . 3 (9): 733– 739. doi : 10.1038/nrmicro1236 . PMID 16138101 . S2CID 41706247 .  
  7. ↑ Porter, Teresita M.; Hajibabaei, Mehrdad (2018). "Ampliación: una guía para enfoques genómicos de alto rendimiento para el análisis de la biodiversidad" . Molecular Ecology . 27 (2): 313– 338. Bibcode : 2018MolEc..27..313P . doi : 10.1111/mec.14478 . ISSN 1365-294X . PMID 29292539 .  
  8. ↑ Hu, YF; Liu, JW; Luo, XX; Xu, ZH; Xia, JW; Zhang, XG; Castañeda-Ruíz, RF; Ma, J (12 de diciembre de 2023). "Análisis filogenéticos multilocus revelan ocho nuevas especies de Distoseptispora del sur de China" . Microbiology Spectrum . 11 (6): e0246823. doi : 10.1128/spectrum.02468-23 . PMID 37905843 . 
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  11. ↑ McGregor KF, Spratt BG, Kalia A, Bennett A, Bilek N, Beall B, Bessen DE (2004). " Tipificación de secuencias multilocus de Streptococcus pyogenes que representa la mayoría de los tipos emm conocidos y distinciones entre estructuras genéticas de subpoblaciones" . J Bacteriol . 186 (13): 4285– 4294. doi : 10.1128/jb.186.13.4285-4294.2004 . PMC 421626. PMID 15205431 .  
  12. ↑ Baldwin; et al. (2009). "La tipificación de secuencias multilocus de Cronobacter sakazakii y Cronobacter malonaticus revela estructuras clonales estables con significado clínico que no se correlacionan con los biotipos" . BMC Microbiology . 9 (1) 223. Bibcode : 2009BMCMb...9..223B . doi : 10.1186/1471-2180-9-223 . PMC 2770063. PMID 19852808 .   
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Lecturas adicionales

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  • Urwin R, Maiden MC; Maiden (octubre de 2003). "Tipificación de secuencias multilocus: una herramienta para la epidemiología global". Trends Microbiol . 11 (10): 479–87 . doi : 10.1016/j.tim.2003.08.006 . PMID 14557031 . 
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  • Chen Y, Zhang W, Knabel SJ; Zhang; Knabel (octubre de 2005). "La tipificación de secuencias de múltiples loci de virulencia aclara la epidemiología de los brotes recientes de listeriosis en los Estados Unidos" . J. Clin. Microbiol . 43 (10): 5291–4 . doi : 10.1128/JCM.43.10.5291-5294.2005 . PMC 1248515. PMID 16208000 .  {{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  • PubMLST - Universidad de Oxford
  • Bases de datos alojadas en University College Cork. Archivadas el 4 de abril de 2009 en Wayback Machine.
  • bases de datos almacenadas en el Instituto Pasteur
  • BioNumerics: Una solución bioinformática universal para almacenar y analizar todos sus datos biológicos. Se puede realizar todo el flujo de trabajo MLST y comparar los resultados con otros métodos de tipificación y/o metadatos. También se pueden obtener secuencias de alelos e identificadores a partir de secuencias del genoma completo.
  • El módulo de genómica microbiana de CLC incluye un conjunto de herramientas y flujos de trabajo listos para usar para MLST en el contexto de metainformación como brote, huésped, ubicación geográfica, etc., y permite una fácil comparación con los resultados de tipificación obtenidos utilizando otros métodos de tipificación.