Selección de golpes

En el cribado de alto rendimiento (HTS), uno de los objetivos principales es seleccionar compuestos (incluidas moléculas pequeñas , siRNAs , shRNAs , genes , etc.) con un efecto de inhibición o activación de magnitud deseada. Un compuesto con un efecto de magnitud deseada en un cribado HTS se denomina "hit". El proceso de selección de hits se denomina selección de hits .

Los experimentos HTS tienen la capacidad de examinar decenas de miles (o incluso millones) de compuestos rápidamente. Por lo tanto, es un desafío extraer significado químico/bioquímico de montones de datos en el proceso de selección de compuestos activos. Para abordar este desafío, se han adoptado métodos analíticos apropiados para la selección de compuestos activos. Hay dos estrategias principales para seleccionar compuestos activos con grandes efectos. ^{[ 1 ]} Una es usar ciertas métricas para clasificar los compuestos según sus efectos y luego seleccionar la mayor cantidad de compuestos potentes que sea práctica para los ensayos de validación . ^{[ 2 ] [ 3 ]} La otra estrategia es probar si un compuesto tiene efectos lo suficientemente fuertes como para alcanzar un nivel preestablecido. En esta estrategia, se deben controlar las tasas de falsos negativos (FNR) y/o las tasas de falsos positivos (FPR). ^{[ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]}

Existen dos tipos principales de experimentos HTS: uno sin réplicas (generalmente en cribados primarios) y otro con réplicas (generalmente en cribados confirmatorios). Los métodos analíticos para la selección de resultados positivos difieren en estos dos tipos de experimentos HTS. Por ejemplo, el método de puntuación z es adecuado para cribados sin réplicas, mientras que la estadística t es adecuada para cribados con réplicas. El cálculo de SSMD para cribados sin réplicas también difiere del de los cribados con réplicas. ^{[ 1 ]}

Existen muchas métricas utilizadas para la selección de resultados positivos en cribados primarios sin réplicas. Las más fáciles de interpretar son el cambio de pliegue , la diferencia media, el porcentaje de inhibición y el porcentaje de actividad. Sin embargo, el inconveniente común a todas estas métricas es que no capturan la variabilidad de los datos de manera efectiva. Para abordar este problema, los investigadores recurrieron al método de puntuación z o SSMD , que puede capturar la variabilidad de los datos en referencias negativas. ^{[ 12 ] [ 13 ]}

El método de puntuación z se basa en la suposición de que los valores medidos (generalmente intensidad de fluorescencia en escala logarítmica) de todos los compuestos investigados en una placa tienen una distribución normal . SSMD también funciona mejor bajo la suposición de normalidad. Sin embargo, los resultados positivos con grandes efectos deberían comportarse de manera muy diferente a la mayoría de los compuestos y, por lo tanto, son valores atípicos. Los artefactos de ensayo fuertes también pueden comportarse como valores atípicos. Por lo tanto, los valores atípicos no son infrecuentes en los experimentos de HTS. Las versiones regulares de la puntuación z y SSMD son sensibles a los valores atípicos y pueden ser problemáticas. En consecuencia, se han propuesto y adoptado métodos robustos como el método de puntuación z*, SSMD *, el método de puntuación B y el método basado en cuantiles para la selección de resultados positivos en cribados primarios sin réplicas. ^{[ 14 ] [ 15 ]}

En una prueba primaria sin réplicas, cada compuesto se mide solo una vez. Por lo tanto, no podemos estimar directamente la variabilidad de los datos para cada compuesto. En cambio, estimamos indirectamente la variabilidad de los datos asumiendo que cada compuesto tiene la misma variabilidad que una referencia negativa en una placa de la prueba. La puntuación z, la puntuación z* y la puntuación B se basan en esta suposición; al igual que la SSMD y la SSMD* para los casos sin réplicas.

En una pantalla con réplicas, podemos estimar directamente la variabilidad de los datos para cada compuesto y, por lo tanto, podemos usar métodos más potentes, como SSMD para casos con réplicas y el estadístico t que no depende de la fuerte suposición en la que se basan la puntuación z y la puntuación z*. Un problema con el uso del estadístico t y los valores p asociados es que se ven afectados tanto por el tamaño de la muestra como por el tamaño del efecto. ^{[ 16 ]} Provienen de pruebas de no diferencia de medias, por lo que no están diseñados para medir el tamaño de los efectos de moléculas pequeñas o siRNA. Para la selección de resultados positivos, el principal interés es el tamaño del efecto en una molécula pequeña o siRNA probada . SSMD evalúa directamente el tamaño de los efectos. ^{[ 17 ]} También se ha demostrado que SSMD es mejor que otros tamaños de efecto comúnmente utilizados. ^{[ 18 ]} El valor poblacional de SSMD es comparable entre experimentos y, por lo tanto, podemos usar el mismo umbral para el valor poblacional de SSMD para medir el tamaño de los efectos de siRNA. ^{[ 19 ]}

SSMD puede superar la desventaja de que el cambio de pliegue promedio no pueda capturar la variabilidad de los datos. Por otro lado, dado que SSMD es la razón entre la media y la desviación estándar, podemos obtener un valor de SSMD grande cuando la desviación estándar es muy pequeña, incluso si la media es pequeña. En algunos casos, un valor medio demasiado pequeño puede no tener un impacto biológico. Por lo tanto, los compuestos con valores de SSMD grandes (o diferenciaciones) pero valores medios demasiado pequeños pueden no ser de interés. El concepto de gráfico de doble linterna se ha propuesto para abordar este problema. En un gráfico de doble linterna , representamos el SSMD frente al cambio de pliegue logarítmico promedio (o porcentaje promedio de inhibición/activación) en los ejes y y x, respectivamente, para todos los compuestos investigados en un experimento. ^{[ 19 ]} Con el gráfico de doble linterna, podemos ver cómo se distribuyen los genes o compuestos en cada categoría en tamaños de efecto, como se muestra en la figura. Mientras tanto, también podemos ver el cambio de pliegue promedio para cada compuesto. ^{[ 19 ] [ 20 ]}

• Tamaño del efecto
• cribado de alto rendimiento
• Puntuación Z
• SSMD
• SMCV
• Plan de doble linterna

• Zhang XHD (2011) "Cribado óptimo de alto rendimiento: diseño experimental práctico y análisis de datos para la investigación de ARN interferente a escala genómica, Cambridge University Press"