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Código genético expandido

No debe existir interferencia entre el nuevo par tRNA/sintasa y las moléculas de tRNA/sintasa existentes, solo con los ribosomas. Un código genético expandido es un código genét...

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No debe existir interferencia entre el nuevo par tRNA/sintasa y las moléculas de tRNA/sintasa existentes, solo con los ribosomas.

Un código genético expandido es un código genético modificado artificialmente en el que uno o más codones específicos se han reasignado para codificar un aminoácido que no se encuentra entre los 22 aminoácidos proteinogénicos comunes codificados naturalmente . [ 1 ]

Los requisitos clave para expandir el código genético son:

La expansión del código genético es un área de investigación de la biología sintética , una disciplina biológica aplicada cuyo objetivo es diseñar sistemas vivos con fines útiles. La expansión del código genético enriquece el repertorio de herramientas útiles disponibles para la ciencia.

En mayo de 2019, investigadores, en un esfuerzo trascendental, informaron sobre la creación de una nueva forma sintética (posiblemente artificial ) de vida viable , una variante de la bacteria Escherichia coli , al reducir el número natural de 64 codones en el genoma bacteriano a 61 codones (eliminando dos de los seis codones que codifican para serina y uno de los tres codones de parada ), de los cuales 59 se utilizaban para codificar 20 aminoácidos . [ 2 ] [ 3 ]

Introducción

Es notable que el código genético de todos los organismos es básicamente el mismo, por lo que todos los seres vivos utilizan el mismo "lenguaje genético". [ 4 ] En general, la introducción de nuevos aminoácidos funcionales no naturales en las proteínas de las células vivas rompe la universalidad del lenguaje genético, lo que idealmente conduce a formas de vida alternativas. [ 5 ] Las proteínas se producen gracias a las moléculas del sistema de traducción, que decodifican los mensajes de ARN en una cadena de aminoácidos. La traducción de la información genética contenida en el ARN mensajero (ARNm) a una proteína es catalizada por los ribosomas . Los ARN de transferencia (ARNt) se utilizan como llaves para decodificar el ARNm en su polipéptido codificado . El ARNt reconoce un codón específico de tres nucleótidos en el ARNm con una secuencia complementaria llamada anticodón en uno de sus bucles. Cada codón de tres nucleótidos se traduce en uno de los veinte aminoácidos que se encuentran naturalmente. [ 6 ] Hay al menos un ARNt para cada codón, y a veces varios codones codifican para el mismo aminoácido. Muchos ARNt son compatibles con varios codones. Una enzima llamada aminoacil-ARNt sintetasa une covalentemente el aminoácido al ARNt apropiado. [ 7 ] La mayoría de las células tienen una sintetasa diferente para cada aminoácido (20 o más sintetasas). Por otro lado, algunas bacterias tienen menos de 20 aminoacil-ARNt sintetasas e introducen el o los aminoácidos "faltantes" mediante la modificación de un aminoácido estructuralmente relacionado por una enzima aminotransferasa . [ 8 ] Una característica aprovechada en la expansión del código genético es el hecho de que la aminoacil-ARNt sintetasa a menudo no reconoce el anticodón, sino otra parte del ARNt, lo que significa que si el anticodón mutara, la codificación de ese aminoácido cambiaría a un nuevo codón. En el ribosoma, la información del ARNm se traduce en un aminoácido específico cuando el codón del ARNm coincide con el anticodón complementario de un ARNt, y el aminoácido unido se agrega a una cadena polipeptídica en crecimiento. Cuando se libera del ribosoma, la cadena polipeptídica se pliega para formar una proteína funcional. [ 7 ]

Para incorporar un nuevo aminoácido al código genético, se requieren varios cambios. Primero, para una traducción exitosa de un nuevo aminoácido, el codón al que se le asigna no puede codificar ya para uno de los 20 aminoácidos naturales. Generalmente se utiliza un codón de terminación ( codón de parada ) o un codón de cuatro bases. [ 6 ] Segundo, se requiere un nuevo par de ARNt y aminoacil-ARNt sintetasa, denominado conjunto ortogonal. El conjunto ortogonal no debe interactuar con los conjuntos endógenos de ARNt y sintetasa, a la vez que es funcionalmente compatible con el ribosoma y otros componentes del aparato de traducción. El sitio activo de la sintetasa se modifica para aceptar únicamente el nuevo aminoácido. Con frecuencia, se examina una biblioteca de sintetasas mutantes para encontrar una que cargue el ARNt con el aminoácido deseado. La sintetasa también se modifica para reconocer únicamente el ARNt ortogonal. [ 6 ] El par de ARNt sintetasa se suele modificar genéticamente en otras bacterias o células eucariotas. [ 9 ]

En este campo de investigación, los 20 aminoácidos proteinogénicos codificados se denominan aminoácidos estándar, o alternativamente aminoácidos naturales o canónicos, mientras que los aminoácidos añadidos se denominan aminoácidos no estándar (NSAA), o aminoácidos no naturales (UAA; término que no se utiliza en artículos que tratan sobre aminoácidos naturales no proteinogénicos, como la fosfoserina ), o aminoácidos no canónicos.

Aminoácidos no estándar

Tirosina y algunas variantes sintéticas de tirosina utilizadas para el marcaje de proteínas. Se han sintetizado diferentes variantes de tirosina que pueden incorporarse a las proteínas mediante un código genético expandido. Las variantes que se muestran aquí se utilizan para la unión química o fotoquímica. Esto significa que el aminoácido incorporado reacciona específicamente con un grupo químico particular (como hidrazidas, aminas, azidas o tioles) o puede activarse mediante luz ultravioleta para formar enlaces cruzados con otros aminoácidos.

El primer elemento del sistema es el aminoácido que se añade al código genético de una determinada cepa de organismo.

Se han añadido más de 71 NSAA diferentes a distintas cepas de E. coli , levadura o células de mamíferos. [ 10 ] Debido a detalles técnicos (síntesis química más sencilla de NSAA, menor interferencia y evolución más fácil de la aminoacil-ARNt sintasa), los NSAA son generalmente más grandes que los aminoácidos estándar y suelen tener un núcleo de fenilalanina, pero con una gran variedad de sustituyentes diferentes. Esto permite un amplio repertorio de nuevas funciones, como el marcaje (véase la figura), como reportero fluorescente ( p. ej. , dansil alanina) o para producir proteínas de traducción en E. coli con modificaciones postraduccionales eucariotas ( p. ej. , fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina). [ 11 ] [ 10 ] [ 12 ]

El trabajo fundacional fue realizado por Rolf Furter, quien utilizó el par de ARNt Phe /PheRS de levadura para incorporar p-fluorofenilalanina en E. coli . [ 13 ]

Los aminoácidos no naturales incorporados a las proteínas incluyen aminoácidos que contienen átomos pesados ​​para facilitar ciertos estudios cristalográficos de rayos X; aminoácidos con propiedades electrónicas y estéricas/de empaquetamiento novedosas; aminoácidos fotoreticulables que pueden utilizarse para sondear las interacciones proteína-proteína in vitro o in vivo; aminoácidos que contienen cetonas, acetilenos, azidas y boronato que pueden utilizarse para introducir selectivamente un gran número de sondas biofísicas, etiquetas y nuevos grupos funcionales químicos en las proteínas in vitro o in vivo ; aminoácidos redox activos para sondear y modular la transferencia de electrones; aminoácidos fotolábiles y fotoisomerizables para fotorregular procesos biológicos; aminoácidos que se unen a metales para catálisis y detección de iones metálicos; aminoácidos que contienen cadenas laterales fluorescentes o infrarrojas activas para sondear la estructura y la dinámica de las proteínas; α-hidroxiácidos y D -aminoácidos como sondas de la conformación del esqueleto y las interacciones de enlaces de hidrógeno; y aminoácidos sulfatados y miméticos de aminoácidos fosforilados como sondas de modificaciones postraduccionales. [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]

La disponibilidad del aminoácido no estándar requiere que el organismo lo importe del medio o lo biosintetice. En el primer caso, el aminoácido no natural se sintetiza primero químicamente en su forma L ópticamente pura. [ 17 ] Luego se agrega al medio de cultivo de la célula. [ 10 ] Generalmente se prueba una biblioteca de compuestos para su uso en la incorporación del nuevo aminoácido, pero esto no siempre es necesario; por ejemplo, varios sistemas de transporte pueden manejar aminoácidos no naturales con cadenas laterales apolares. En el segundo caso, es necesario diseñar una ruta biosintética; por ejemplo, una cepa de E. coli que biosintetiza un nuevo aminoácido (p-aminofenilalanina) a partir de fuentes de carbono básicas y lo incluye en su código genético. [ 16 ] [ 18 ] [ 19 ] Otro ejemplo es la producción de fosfoserina, un metabolito natural, que requirió la alteración del flujo de su ruta para aumentar su producción. [ 12 ]

Asignación de codones

Otro elemento del sistema es un codón que se asigna al nuevo aminoácido.

Un problema importante para la expansión del código genético es que no hay codones libres. El código genético tiene una disposición no aleatoria que muestra signos reveladores de varias fases de la evolución primordial; sin embargo, desde entonces se ha congelado en su lugar y está conservado casi universalmente. [ 20 ] No obstante, algunos codones son más raros que otros. De hecho, en E. coli (y en todos los organismos) el uso de codones no es uniforme, sino que presenta varios codones raros (véase la tabla), siendo el más raro el codón de parada ámbar (UAG).

supresión del codón ámbar

La posibilidad de reasignar codones fue descubierta por Normanly et al. en 1990, cuando una cepa mutante viable de E. coli leyó el codón de parada UAG ("ámbar") . [ 22 ] Esto fue posible gracias a la rareza de este codón y al hecho de que el factor de liberación 1 por sí solo hace que el codón ámbar termine la traducción. Más tarde, en el laboratorio de Schultz , la tRNATyr/tirosil-tRNA sintetasa (TyrRS) de Methanococcus jannaschii , una arqueobacteria, [ 6 ] se utilizó para introducir una tirosina en lugar de STOP, el valor predeterminado del codón ámbar. [ 23 ] Esto fue posible debido a las diferencias entre las sintetasas bacterianas endógenas y la sintetasa arqueal ortóloga, que no se reconocen entre sí. Posteriormente, el grupo desarrolló el par ortólogo tRNA/sintasa para utilizar el aminoácido no estándar O -metiltirosina. [ 6 ] A esto le siguió la naftilalanina más grande [ 24 ] y la benzoilfenilalanina de reticulación fotoinducida, [ 25 ] que demostró la utilidad potencial del sistema.

El codón ámbar es el menos utilizado en Escherichia coli , pero su secuestro resulta en una pérdida sustancial de aptitud. De hecho, un estudio encontró que al menos 83 péptidos se vieron afectados significativamente por la lectura completa. [ 26 ] Además, el etiquetado fue incompleto. Como consecuencia, se han creado varias cepas para reducir el costo de aptitud, incluyendo la eliminación de todos los codones ámbar del genoma. En la mayoría de las cepas de E. coli K-12 (es decir, Escherichia coli (biología molecular) para los pedigríes de cepas) hay 314 codones de parada UAG. En consecuencia, se ha invertido una cantidad gigantesca de trabajo en el reemplazo de estos. Un enfoque pionero del grupo del Prof. George Church de Harvard, denominado MAGE en CAGE: este se basó en una transformación multiplex y la posterior recombinación de cepas para eliminar todos los codones UAG; esta última parte presentó un punto de parada en un primer artículo, [ 27 ] pero se superó. Esto dio como resultado la cepa de E. coli C321.ΔA, que carece de todos los codones UAG y RF1. [ 28 ] Esto permitió realizar un experimento con esta cepa para hacerla "adicta" al aminoácido bifenilalanina mediante la evolución de varias enzimas clave para que lo requirieran estructuralmente, poniendo así su código genético expandido bajo selección positiva. [ 29 ]

Reasignación de codones de sentido raro

Además del codón ámbar, también se han considerado codones de sentido raros. El codón AGG codifica para arginina, pero se ha modificado con éxito una cepa para que codifique para 6- N -aliloxicarbonil-lisina. [ 30 ] Otro candidato es el codón AUA, que es inusual ya que su ARNt respectivo debe diferenciarse del AUG que codifica para metionina (principalmente, isoleucina, de ahí su ubicación). Para ello, el ARNt AUA tiene una base especial, la lisidina. La eliminación de la sintasa ( tilS ) fue posible gracias a la sustitución del ARNt nativo por el de Mycoplasma mobile (sin lisidina). La aptitud reducida es un primer paso para presionar a la cepa a perder todas las instancias de AUA, lo que permite su uso para la expansión del código genético. [ 31 ]

La cepa de E. coli Syn61 es una variante en la que se eliminan todos los usos de los codones TCG (Ser), TCA (Ser) y TAG (STOP) mediante un genoma sintético (véase §  Genoma sintético recodificado más adelante) que contiene 18.214 sustituciones. Al eliminar los genes de ARNt innecesarios y RF1, se produjo la cepa Syn61Δ3. Los tres codones liberados quedan disponibles para añadir tres residuos especiales, como se demuestra en la cepa "Syn61Δ3(ev4)". [ 32 ] Una cepa más reciente, Syn57, libera 7 codones (101.553 sustituciones) y se espera que permita añadir más residuos especiales. [ 33 ]

Codones de cuatro bases (cuádruple)

Si bien los codones tripletes son la base del código genético en la naturaleza, el cambio de marco programado +1 es un proceso natural que permite el uso de una secuencia de cuatro nucleótidos (codón cuádruple) para codificar un aminoácido. [ 34 ] Los avances recientes en la ingeniería del código genético también mostraron que el codón cuádruple podría usarse para codificar aminoácidos no estándar en condiciones experimentales. [ 35 ] [ 36 ] [ 37 ] Esto permitió el uso simultáneo de dos aminoácidos no naturales, p -azidofenilalanina (pAzF) y N6-[(2-propiniloxi)carbonil]lisina (CAK), que se entrecruzan entre sí mediante la cicloadición de Huisgen . [ 38 ] La decodificación cuádruple en cepas de tipo silvestre, no recodificadas es muy ineficiente. [ 38 ] Esto se debe a que la interacción entre los ARNt diseñados con complejos ternarios u otros componentes de la traducción no es tan favorable y fuerte como con los elementos de traducción endógenos de la célula. [ 39 ] Este problema puede superarse mediante la ingeniería y evolución específicas de ARNt que puedan decodificar codones cuádruples en cepas no recodificadas. [ 40 ] De esta manera se pueden generar hasta 4 pares ortogonales cuádruples de ARNt/ARNt sintetasa diferentes. [ 41 ] El enfoque de decodificación de codones cuádruples también se ha aplicado a la construcción de una vacuna contra el VIH-1. [ 42 ]

Par de ARNt/sintetasa

Otro elemento clave es el par ARNt/sintetasa.

El conjunto ortólogo de sintetasa y ARNt puede mutarse y seleccionarse mediante evolución dirigida para cargar el ARNt con un aminoácido diferente, incluso novedoso. Las mutaciones en el plásmido que contiene el par pueden introducirse mediante PCR con propensión a errores o mediante cebadores degenerados para el sitio activo de la sintetasa. La selección implica múltiples rondas de un proceso de dos pasos, donde el plásmido se transfiere a células que expresan cloranfenicol acetiltransferasa con un codón ámbar prematuro. En presencia de cloranfenicol tóxico y el aminoácido no natural, las células supervivientes habrán anulado el codón ámbar utilizando el ARNt ortogonal aminoacilado con los aminoácidos estándar o con el no natural. Para eliminar el primero, el plásmido se inserta en células con un gen de barnasa (tóxico) con un codón ámbar prematuro pero sin el aminoácido no natural, eliminando así todas las sintetasas ortogonales que no reconocen específicamente el aminoácido no natural. [ 6 ] Además de la recodificación del ARNt a un codón diferente, pueden mutarse para reconocer un codón de cuatro bases, lo que permite opciones de codificación libre adicionales. [ 43 ] El aminoácido no natural, como resultado, introduce diversas propiedades fisicoquímicas y biológicas para ser utilizado como herramienta para explorar la estructura y función de las proteínas o para crear proteínas novedosas o mejoradas con fines prácticos.

Se han desarrollado varios métodos para seleccionar la sintetasa que acepta únicamente el aminoácido no natural. Uno de ellos consiste en utilizar una combinación de selección positiva y negativa.

Conjuntos ortogonales en organismos modelo

Los pares ortogonales de sintetasa y ARNt que funcionan para un organismo pueden no funcionar para otro, ya que la sintetasa puede aminoacilar incorrectamente los ARNt endógenos o el propio ARNt puede ser aminoacilado incorrectamente por una sintetasa endógena. En consecuencia, los conjuntos creados hasta la fecha difieren entre organismos.

En 2017, se informó sobre un ratón modificado genéticamente con un código genético extendido que puede producir proteínas con aminoácidos no naturales. [ 57 ]

Ribosomas ortogonales

De forma similar a los ARNt ortogonales y las aminoacil-ARNt sintetasas (aaRS), se han diseñado ribosomas ortogonales para que funcionen en paralelo a los ribosomas naturales. Idealmente, los ribosomas ortogonales utilizan transcritos de ARNm diferentes a los de sus homólogos naturales y, en última instancia, también deberían recurrir a un conjunto distinto de ARNt. Esto debería mitigar parte de la pérdida de aptitud que aún se produce con técnicas como la supresión del codón ámbar. Además, los ribosomas ortogonales pueden mutarse y optimizarse para tareas específicas, como el reconocimiento de codones cuádruples. Dicha optimización no es posible, o resulta altamente desventajosa, para los ribosomas naturales.

o-Ribosoma

En 2005, se publicaron tres conjuntos de ribosomas que no reconocían el ARNm natural, sino que traducían un conjunto separado de ARNm ortogonal (o-ARNm). [ 58 ] Esto se logró cambiando la secuencia de reconocimiento del ARNm, la secuencia Shine-Dalgarno , y la secuencia de reconocimiento correspondiente en el ARNr 16S de los ribosomas, la llamada secuencia Anti-Shine-Dalgarno. De esta manera, el apareamiento de bases, que generalmente se pierde si cualquiera de las secuencias está mutada, permanece disponible. Sin embargo, las mutaciones en el ARNr 16S no se limitaron a los nucleótidos de apareamiento de bases obvios de la secuencia Anti-Shine-Dalgarno clásica.

Ribo-X

En 2007, el grupo de Jason W. Chin presentó un ribosoma ortogonal, optimizado para la supresión del codón ámbar. [ 59 ] El ARNr 16S fue mutado de tal manera que se unía al factor de liberación RF1 con menor afinidad que el ribosoma natural. Este ribosoma no eliminó el problema de la disminución de la aptitud celular causada por la supresión de los codones de parada en las proteínas naturales. Sin embargo, gracias a la especificidad mejorada, aumentó significativamente el rendimiento de la proteína diana sintetizada correctamente (de ~20% a >60% para la supresión de un codón ámbar y de <1% a >20% para dos codones ámbar).

Ribo-Q

En 2010, el grupo de Jason W. Chin presentó una versión optimizada del ribosoma ortogonal. El Ribo-Q es un ARNr 16S optimizado para reconocer ARNt, que poseen anticodones cuádruples para reconocer codones cuádruples, en lugar de los codones tripletes naturales. [ 38 ] Con este enfoque, el número de codones posibles aumenta de 64 a 256. Incluso considerando una variedad de codones de parada, potencialmente se podrían codificar más de 200 aminoácidos diferentes de esta manera.

Grapado de ribosomas

Los ribosomas ortogonales descritos anteriormente se centran en la optimización del ARNr 16S. Hasta ahora, este ARNr 16S optimizado se combinaba con subunidades grandes naturales para formar ribosomas ortogonales. Si el ARNr 23S , el principal componente de ARN de la subunidad ribosómica grande, también se iba a optimizar, era necesario asegurar que no hubiera interferencia en el ensamblaje de los ribosomas ortogonales y naturales (véase la figura B). Para garantizar que el ARNr 23S optimizado solo formara ribosomas con el ARNr 16S optimizado, ambos ARNr se combinaron en un solo transcrito. [ 60 ] Al insertar la secuencia del ARNr 23S en una región de bucle de la secuencia del ARNr 16S, ambas subunidades siguen adoptando plegamientos funcionales. Dado que los dos ARNr están unidos y, por lo tanto, en constante proximidad, se unen preferentemente entre sí, y no a otras subunidades ribosómicas libres.

Centro de peptidiltransferasa modificado

En 2014, se demostró que al alterar el centro de peptidiltransferasa del ARNr 23S, se podían crear ribosomas que utilizan grupos ortogonales de ARNt. [ 61 ] El extremo 3' de los ARNt se conserva universalmente como CCA. Las dos citidinas se emparejan con dos guaninas del ARNr 23S para unir el ARNt al ribosoma. Esta interacción es necesaria para la fidelidad de la traducción. Sin embargo, al co-mutar los nucleótidos de unión de tal manera que aún puedan emparejarse, la fidelidad de la traducción puede conservarse. El extremo 3' del ARNt se muta de CCA a CGA, mientras que dos nucleótidos de citidina en los sitios A y P de los ribosomas se mutan a guanidina. Esto da lugar a ribosomas que no aceptan los ARNt naturales como sustratos y a ARNt que no pueden ser utilizados como sustrato por los ribosomas naturales. Para utilizar dichos ARNt de forma eficaz, tendrían que ser aminoacilados por aminoacil-ARNt sintetasas (aaRS) específicas y ortogonales. La mayoría de las aaRS naturales reconocen el extremo 3' de su ARNt correspondiente. [ 62 ] [ 63 ] Todavía no se dispone de aaRS para estos ARNt con mutación en el extremo 3'. Hasta el momento, este sistema solo ha demostrado funcionar en un entorno de traducción in vitro donde la aminoacilación del ARNt ortogonal se logró utilizando las llamadas "flexizimas".Las flexizimas, desarrolladas por primera vez en el laboratorio de Hiroaki Suga en la Universidad de Tokio , son ribozimas con actividad de aminoacilación de ARNt. [ 64 ]

Aplicaciones

Con un código genético expandido, el aminoácido no natural puede dirigirse genéticamente a cualquier sitio elegido en la proteína de interés. La alta eficiencia y fidelidad de este proceso permite un mejor control de la ubicación de la modificación en comparación con la modificación postraduccional de la proteína, que, en general, se dirige a todos los aminoácidos del mismo tipo, como el grupo tiol de la cisteína y el grupo amino de la lisina. [ 65 ] Además, un código genético expandido permite realizar modificaciones in vivo . La capacidad de dirigir de forma específica fragmentos químicos sintetizados en laboratorio a proteínas permite muchos tipos de estudios que de otro modo serían extremadamente difíciles, tales como:

  • Estudio de la estructura y función de las proteínas: Mediante el uso de aminoácidos de tamaño ligeramente diferente, como la O -metiltirosina o la dansil alanina, en lugar de la tirosina, y mediante la inserción de fragmentos reporteros codificados genéticamente (que cambian de color y/o son reactivos al giro) en sitios específicos de la proteína, se puede medir información química sobre la estructura y función de la proteína.
  • Explorando el papel de las modificaciones postraduccionales en la estructura y función de las proteínas: Mediante el uso de aminoácidos que imitan modificaciones postraduccionales como la fosfoserina, se puede obtener proteína biológicamente activa, y la naturaleza específica del sitio de incorporación del aminoácido puede conducir a información sobre cómo la posición, la densidad y la distribución de la fosforilación de proteínas afectan la función de la proteína. [ 66 ] [ 67 ] [ 68 ] [ 69 ]
  • Identificación y regulación de la actividad proteica: Mediante el uso de aminoácidos fotolábiles, la función de las proteínas puede "activarse" o desactivarse iluminando el organismo.
  • Modificación del modo de acción de una proteína: Se puede partir del gen de una proteína que se une a una determinada secuencia de ADN y, mediante la inserción de un aminoácido químicamente activo en el sitio de unión, convertirla en una proteína que corta el ADN en lugar de unirse a él.
  • Mejorar la inmunogenicidad y superar la autotolerancia: Al reemplazar tirosinas estratégicamente elegidas con p -nitrofenilalanina, una proteína propia tolerada puede volverse inmunogénica. [ 70 ]
  • Destrucción selectiva de componentes celulares específicos: mediante un código genético expandido, se pueden incorporar grupos químicos destructivos no naturales (a veces llamados "cabezas huecas químicas") en proteínas que atacan componentes celulares específicos. [ 71 ]
  • Produciendo mejor proteína: la evolución de bacteriófagos T7 en una cepa de E. coli no evolutiva que codificaba 3-iodotirosina en el codón ámbar, resultó en una población más apta que el tipo silvestre gracias a la presencia de iodotirosina en su proteoma [ 72 ].
  • Investigación de la localización de proteínas y la interacción proteína-proteína en bacterias. [ 73 ]

Futuro

La expansión del código genético aún está en sus inicios. La metodología actual utiliza solo un aminoácido no estándar a la vez, mientras que idealmente se podrían usar varios. De hecho, el grupo de Jason Chin batió recientemente el récord de una cepa de E. coli genéticamente modificada que puede incorporar simultáneamente hasta cuatro aminoácidos no naturales. [ 74 ] Además, se ha desarrollado software que permite la combinación de ribosomas ortogonales y pares de ARNt/RS no naturales para mejorar el rendimiento y la fidelidad de las proteínas. [ 74 ]

genoma sintético recodificado

Una forma de lograr la codificación de múltiples aminoácidos no naturales es mediante la síntesis de un genoma reescrito. [ 75 ] En 2010, a un costo de $40 millones, se construyó un organismo, Mycoplasma laboratorium , que estaba controlado por un genoma sintético, pero no recodificado. [ 76 ] El primer organismo genéticamente recodificado fue creado por una colaboración entre los laboratorios de George Church y Farren Isaacs, cuando el tipo silvestre de E. coli MG1655 fue recodificado de tal manera que los 321 codones de parada UAG conocidos fueron sustituidos por codones UAA sinónimos y el factor de liberación 1 fue eliminado para eliminar la interacción con el codón de parada exógeno y mejorar la síntesis de proteínas no naturales. [ 28 ] En 2019, se creó Escherichia coli Syn61, con un genoma recodificado de 4 megabases que consta de solo 61 codones en lugar de los 64 naturales. [ 3 ] [ 2 ] Además de la eliminación del uso de codones raros, es necesario aumentar la especificidad del sistema ya que muchos ARNt reconocen varios codones [ 75 ]

Alfabeto genético ampliado

Otro enfoque consiste en aumentar el número de nucleobases para incrementar la capacidad de codificación.

Un par de bases no naturales (UBP) es una subunidad (o nucleobase ) de ADN diseñada que se crea en un laboratorio y no se encuentra en la naturaleza. El grupo de Ichiro Hirao en el Instituto RIKEN de Japón logró una demostración de UBP in vitro . En 2002, desarrollaron un par de bases no naturales entre 2-amino-8-(2-tienil)purina (s) y piridina-2-ona (y) que funciona in vitro en la transcripción y traducción para la incorporación sitio-específica de aminoácidos no estándar en proteínas. [ 77 ] En 2006, crearon 7-(2-tienil)imidazo[4,5-b]piridina (Ds) y pirrol-2-carbaldehído (Pa) como un tercer par de bases para la replicación y transcripción. [ 78 ] Posteriormente, se descubrió que Ds y 4-[3-(6-aminohexanamido)-1-propinil]-2-nitropirrol (Px) formaban un par de alta fidelidad en la amplificación por PCR. [ 79 ] [ 80 ] En 2013, aplicaron el par Ds-Px a la generación de aptámeros de ADN mediante selección in vitro (SELEX) y demostraron que la expansión del alfabeto genético aumenta significativamente las afinidades de los aptámeros de ADN a las proteínas diana. [ 81 ]

En 2012, un grupo de científicos estadounidenses liderado por Floyd Romesberg, un biólogo químico del Instituto de Investigación Scripps en San Diego, California, publicó que su equipo diseñó un par de bases no naturales (UBP). [ 82 ] Los dos nuevos nucleótidos artificiales o pares de bases no naturales (UBP) se denominaron " d5SICS " y " dNaM ". Más técnicamente, estos nucleótidos artificiales que contienen nucleobases hidrofóbicas , presentan dos anillos aromáticos fusionados que forman un complejo (d5SICS–dNaM) o par de bases en el ADN. [ 83 ] [ 84 ] En 2014, el mismo equipo del Instituto de Investigación Scripps informó que sintetizaron un segmento de ADN circular conocido como plásmido que contenía pares de bases naturales TA y CG junto con el UBP de mejor rendimiento que el laboratorio de Romesberg había diseñado, y lo insertaron en células de la bacteria común E. coli que replicó con éxito los pares de bases no naturales a través de múltiples generaciones. [ 85 ] Este es el primer ejemplo conocido de un organismo vivo que transmite un código genético expandido a las generaciones posteriores. [ 83 ] [ 86 ] Esto se logró en parte mediante la adición de un gen de alga de apoyo que expresa un transportador de nucleótido trifosfato que importa eficientemente los trifosfatos de d5SICSTP y dNaMTP a las bacterias E. coli . [ 83 ] Luego, las vías naturales de replicación bacteriana los utilizan para replicar con precisión el plásmido que contiene d5SICS–dNaM.

La incorporación exitosa de un tercer par de bases en un microorganismo vivo representa un avance significativo hacia el objetivo de ampliar considerablemente el número de aminoácidos que puede codificar el ADN, expandiendo así el potencial de los organismos vivos para producir nuevas proteínas . [ 85 ] Las cadenas artificiales de ADN aún no codifican nada, pero los científicos especulan que podrían diseñarse para fabricar nuevas proteínas con posibles usos industriales o farmacéuticos. [ 87 ]

En mayo de 2014, los investigadores anunciaron que habían introducido con éxito dos nuevos nucleótidos artificiales en el ADN bacteriano y que, al incluir nucleótidos artificiales individuales en los medios de cultivo, lograron inducir la amplificación de los plásmidos que contenían los nucleótidos artificiales por un factor de 2 × 10 7 (24 duplicaciones); no crearon ARNm ni proteínas capaces de utilizar los nucleótidos artificiales. [ 83 ] [ 88 ] [ 89 ] [ 90 ]

Método de incorporación selectiva por presión (SPI) para la producción de aloproteínas

Se han realizado numerosos estudios que han producido proteínas con aminoácidos no estándar, pero estos no alteran el código genético. Estas proteínas, denominadas aloproteínas , se obtienen incubando células con un aminoácido no natural en ausencia de un aminoácido codificado similar, de modo que el primero se incorpore a la proteína en lugar del segundo; por ejemplo, el ácido L -2-aminohexanoico (Ahx) en lugar de la metionina (Met). [ 91 ]

Estos estudios se basan en la actividad promiscua natural de la aminoacil-ARNt sintetasa para agregar a su ARNt diana un aminoácido no natural (es decir, un análogo) similar al sustrato natural, por ejemplo, la metionil-ARNt sintetasa confunde la isoleucina con la metionina. [ 92 ] En cristalografía de proteínas, por ejemplo, la adición de selenometionina al medio de un cultivo de una cepa auxótrofa de metionina da como resultado proteínas que contienen selenometionina en lugar de metionina ( es decir, dispersión anómala de múltiples longitudes de onda por una razón). [ 93 ] Otro ejemplo es que se agregan L-foto-leucina y fotometionina en lugar de leucina y metionina para marcar proteínas cruzadamente. [ 94 ] De manera similar, algunos hongos tolerantes al telurio pueden incorporar telurocisteína y telurometionina en su proteína en lugar de cisteína y metionina. [ 95 ] El objetivo de expandir el código genético es más radical, ya que no reemplaza un aminoácido, sino que agrega uno o más al código. Por otro lado, los reemplazos a nivel de proteoma se realizan de manera más eficiente mediante sustituciones globales de aminoácidos. Por ejemplo, se han intentado sustituciones globales a nivel de proteoma de aminoácidos naturales con análogos fluorados en E. coli [ 96 ] y B. subtilis . [ 97 ] Budisa y Söll informaron en 2015 sobre una sustitución completa de triptófano con tienopirrol-alanina en respuesta a 20899 codones UGG en E. coli . [ 98 ] Además, muchos fenómenos biológicos, como el plegamiento y la estabilidad de las proteínas, se basan en efectos sinérgicos en muchas posiciones de la secuencia proteica. [ 99 ]

En este contexto, el método SPI genera variantes de proteínas recombinantes o aloproteínas directamente mediante la sustitución de aminoácidos naturales por sus homólogos no naturales. [ 100 ] Un huésped de expresión auxótrofo de aminoácidos se complementa con un análogo de aminoácido durante la expresión de la proteína diana. [ 101 ] Este enfoque evita los inconvenientes de los métodos basados ​​en la supresión [ 102 ] y es superior a ellos en términos de eficiencia, reproducibilidad y una configuración experimental extremadamente simple. [ 103 ] Numerosos estudios demostraron cómo la sustitución global de aminoácidos canónicos con varios análogos isostéricos causó perturbaciones estructurales mínimas pero cambios drásticos en las propiedades termodinámicas, [ 104 ] de plegamiento, [ 105 ] de agregación , [ 106 ] espectrales , [ 107 ] [ 108 ] y enzimáticas. [ 109 ]

síntesis in vitro

La expansión del código genético descrita anteriormente se realiza in vivo . Una alternativa es el cambio de codificación mediante experimentos de traducción in vitro . Esto requiere la eliminación de todos los ARNt y la reintroducción selectiva de ciertos ARNt aminoacilados, algunos de ellos aminoacilados químicamente. [ 110 ]

Síntesis química

Existen diversas técnicas para producir péptidos químicamente; generalmente se utiliza la química de protección en fase sólida. Esto significa que cualquier aminoácido (protegido) puede incorporarse a la secuencia naciente.

En noviembre de 2017, un equipo del Instituto de Investigación Scripps informó haber construido un genoma bacteriano semisintético de E. coli utilizando seis nucleótidos diferentes (frente a los cuatro que se encuentran en la naturaleza). Las dos "letras" adicionales forman un tercer par de bases no naturales. Los organismos resultantes pudieron prosperar y sintetizar proteínas utilizando "aminoácidos no naturales". [ 111 ] [ 112 ] El par de bases no naturales utilizado es dNaM –dTPT3. [ 112 ] Este par de bases no naturales se ha demostrado previamente, [ 113 ] [ 114 ] pero este es el primer informe de transcripción y traducción de proteínas utilizando un par de bases no naturales.

Véase también

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