Mutagénesis (técnica de biología molecular)

En biología molecular , la mutagénesis es una técnica de laboratorio importante mediante la cual se diseñan deliberadamente mutaciones en el ADN para producir bibliotecas de genes mutantes, proteínas, cepas bacterianas u otros organismos genéticamente modificados . Los diversos componentes de un gen, así como sus elementos reguladores y sus productos génicos , pueden mutarse para examinar en detalle el funcionamiento de un locus , proceso o producto genético. La mutación puede producir proteínas mutantes con propiedades interesantes o funciones mejoradas o novedosas que pueden tener utilidad comercial. También se pueden producir cepas mutantes con aplicaciones prácticas o que permitan investigar la base molecular de una función celular específica.

Actualmente existen muchos métodos de mutagénesis. Inicialmente, las mutaciones inducidas artificialmente en el laboratorio eran completamente aleatorias, utilizando mecanismos como la irradiación UV . La mutagénesis aleatoria no puede dirigirse a regiones o secuencias específicas del genoma; sin embargo, con el desarrollo de la mutagénesis dirigida , se pueden realizar cambios más específicos, lo que la hace útil en situaciones donde la mutagénesis aleatoria no lo es. Desde 2013, el desarrollo de la tecnología CRISPR / Cas9 , basada en un sistema de defensa viral procariota, ha permitido la edición o mutagénesis de un genoma in vivo . ^{[ 1 ]} Otras técnicas de mutagénesis incluyen la mutagénesis combinatoria y la mutagénesis insercional. La mutagénesis no aleatoria se puede utilizar para clonar ADN , ^{[ 2 ]} investigar los efectos de los mutágenos, ^{[ 3 ]} y diseñar proteínas. ^{[ 4 ]} También tiene aplicaciones médicas, como ayudar a pacientes inmunocomprometidos , la investigación y el tratamiento de enfermedades como el VIH y el cáncer , y la cura de enfermedades como la beta talasemia . ^{[ 5 ]}

Los primeros enfoques de mutagénesis se basaban en métodos que producían mutaciones completamente aleatorias. En estos métodos, las células u organismos se exponen a mutágenos como la radiación UV o sustancias químicas mutagénicas, y luego se seleccionan los mutantes con las características deseadas. ^Hermann Muller descubrió en 1927 que los rayos X pueden causar mutaciones genéticas en las moscas de la fruta [ ^{6 ]} y posteriormente utilizó los mutantes que creó para sus estudios en genética ^{[ 7 ]} . Para Escherichia coli , los mutantes pueden seleccionarse primero mediante la exposición a la radiación UV y luego sembrarse en un medio de agar . Las colonias formadas se replican en placas , una en un medio rico y otra en un medio mínimo, y los mutantes que tienen requerimientos nutricionales específicos pueden identificarse por su incapacidad para crecer en el medio mínimo. Se pueden repetir procedimientos similares con otros tipos de células y con diferentes medios de selección.

Posteriormente se desarrollaron varios métodos para generar mutaciones aleatorias en proteínas específicas con el fin de buscar mutantes con propiedades interesantes o mejoradas. Estos métodos pueden implicar el uso de nucleótidos dopados en la síntesis de oligonucleótidos , o la realización de una reacción de PCR en condiciones que aumentan la incorporación errónea de nucleótidos (PCR propensa a errores), por ejemplo, reduciendo la fidelidad de la replicación o utilizando análogos de nucleótidos. ^{[ 8 ]} Una variación de este método para integrar mutaciones no sesgadas en un gen es la mutagénesis de saturación de secuencia . ^{[ 9 ]} Los productos de PCR que contienen mutaciones se clonan en un vector de expresión y las proteínas mutantes producidas pueden caracterizarse.

En estudios con animales, se han utilizado agentes alquilantes como la N -etil- N -nitrosourea (ENU) para generar ratones mutantes . ^{[ 10 ] [ 11 ]} El metanosulfonato de etilo (EMS) también se utiliza con frecuencia para generar mutantes de animales, plantas y virus. ^{[ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]}

En una ley de la Unión Europea (como la directiva 2001/18), este tipo de mutagénesis puede utilizarse para producir OMG, pero los productos están exentos de regulación: sin etiquetado, sin evaluación. ^{[ 15 ]}

Antes del desarrollo de las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, todas las mutaciones realizadas eran aleatorias, y los científicos tenían que utilizar la selección para el fenotipo deseado para encontrar la mutación deseada. Las técnicas de mutagénesis aleatoria tienen una ventaja en términos de cuántas mutaciones se pueden producir; sin embargo, si bien la mutagénesis aleatoria puede producir un cambio en nucleótidos individuales, no ofrece mucho control en cuanto a qué nucleótido se está cambiando. ^{[ 5 ]} Por lo tanto, muchos investigadores buscan introducir cambios seleccionados en el ADN de una manera precisa y específica del sitio. Los primeros intentos utilizan análogos de nucleótidos y otros químicos que se utilizaron por primera vez para generar mutaciones puntuales localizadas . ^{[ 16 ]} Dichos químicos incluyen la aminopurina , que induce una transición de AT a GC , ^{[ 17 ]} mientras que la nitrosoguanidina , ^{[ 18 ]} el bisulfito , ^{[ 19 ]} y la N ⁴ -hidroxicitidina pueden inducir una transición de GC a AT. ^{[ 20 ] [ 21 ]} Estas técnicas permiten diseñar mutaciones específicas en una proteína; Sin embargo, no son flexibles con respecto a los tipos de mutantes generados, ni son tan específicos como los métodos posteriores de mutagénesis dirigida, por lo que presentan cierto grado de aleatoriedad. Otras tecnologías, como la escisión del ADN en sitios específicos del cromosoma , la adición de nuevos nucleótidos y el intercambio de pares de bases, permiten ahora decidir dónde pueden producirse las mutaciones. ^{[ 11 ] [ 8 ]}

Las técnicas actuales para la mutagénesis sitio-específica tienen su origen en la técnica de extensión de cebadores desarrollada en 1978. Estas técnicas suelen implicar el uso de oligonucleótidos mutagénicos prefabricados en una reacción de extensión de cebadores con ADN polimerasa . Este método permite la mutación puntual , la deleción o la inserción de pequeños fragmentos de ADN en sitios específicos. Los avances metodológicos han convertido esta mutagénesis en un proceso relativamente sencillo y eficiente. ^{[ 3 ]}

Constantemente se desarrollan métodos más novedosos y eficientes de mutagénesis dirigida. Por ejemplo, una técnica denominada "extracto de clonación por ligación sin fisuras" (o SLiCE, por sus siglas en inglés) permite la clonación de ciertas secuencias de ADN dentro del genoma, y ​​se puede insertar más de un fragmento de ADN en el genoma a la vez. ^{[ 2 ]}

La mutagénesis dirigida permite investigar el efecto de mutaciones específicas. Tiene numerosos usos; por ejemplo, se ha utilizado para determinar la susceptibilidad de ciertas especies a sustancias químicas de uso frecuente en laboratorios. El experimento empleó mutagénesis dirigida para simular las mutaciones esperadas de la sustancia química específica. La mutación resultó en un cambio en aminoácidos específicos y se analizaron los efectos de esta mutación. ^{[ 3 ]}

El enfoque dirigido a sitios específicos puede realizarse sistemáticamente mediante técnicas como la mutagénesis por escaneo de alanina , en la que los residuos se mutan sistemáticamente a alanina para identificar aquellos importantes para la estructura o función de una proteína. ^{[ 22 ]} Otro enfoque integral es la mutagénesis de saturación de sitio, donde un codón o un conjunto de codones se sustituyen por todos los aminoácidos posibles en posiciones específicas. ^{[ 23 ] [ 24 ]}

La mutagénesis combinatoria es una técnica de ingeniería de proteínas dirigida a sitios específicos mediante la cual se pueden diseñar simultáneamente múltiples mutantes de una proteína basándose en el análisis de los efectos aditivos de mutaciones individuales. ^{[ 25 ]} Proporciona un método útil para evaluar el efecto combinatorio de un gran número de mutaciones en la función de la proteína. ^{[ 26 ]} Mediante análisis combinatorio, se puede examinar un gran número de mutantes para una característica particular. ^{[ 25 ]} En esta técnica, se pueden modificar exhaustivamente múltiples posiciones o secuencias cortas a lo largo de una cadena de ADN para obtener una biblioteca completa de proteínas mutantes. ^{[ 25 ]} La tasa de incidencia de variantes beneficiosas se puede mejorar mediante diferentes métodos para construir bibliotecas de mutagénesis. Un enfoque de esta técnica consiste en extraer y reemplazar una porción de la secuencia de ADN con una biblioteca de secuencias que contengan todas las combinaciones posibles en el sitio de mutación deseado. El contenido del segmento insertado puede incluir secuencias de importancia estructural, propiedad inmunogénica o función enzimática. También se puede insertar un segmento aleatoriamente en el gen para evaluar la importancia estructural o funcional de una parte particular de una proteína. ^{[ 25 ]}

La inserción de uno o más pares de bases, que da lugar a mutaciones en el ADN, también se conoce como mutagénesis insercional . ^{[ 27 ]} Las mutaciones diseñadas, como estas, pueden proporcionar información importante en la investigación del cáncer, como información mecanicista sobre el desarrollo de la enfermedad. Los retrovirus y los transposones son las principales herramientas instrumentales en la mutagénesis insercional. Los retrovirus, como el virus del tumor mamario del ratón y el virus de la leucemia murina, pueden utilizarse para identificar genes implicados en la carcinogénesis y comprender las vías biológicas de cánceres específicos. ^{[ 28 ]} Los transposones, segmentos cromosómicos que pueden sufrir transposición, pueden diseñarse y aplicarse a la mutagénesis insercional como instrumento para el descubrimiento de genes cancerígenos. ^{[ 28 ]} Estos segmentos cromosómicos permiten aplicar la mutagénesis insercional a prácticamente cualquier tejido de elección, al tiempo que permiten una secuenciación del ADN más completa e imparcial . ^{[ 28 ]}

Los investigadores han descubierto cuatro mecanismos de mutagénesis por inserción que pueden utilizarse en humanos. El primer mecanismo se denomina inserción de potenciadores. Los potenciadores aumentan la transcripción de un gen específico al interactuar con su promotor. Este mecanismo se utilizó inicialmente para ayudar a pacientes con inmunodeficiencia grave que necesitaban un trasplante de médula ósea . Posteriormente, se insertaron gammaretrovirus portadores de potenciadores en los pacientes. El segundo mecanismo se denomina inserción de promotores. Los promotores proporcionan a nuestras células las secuencias específicas necesarias para iniciar la traducción . La inserción de promotores ha ayudado a los investigadores a comprender mejor el virus del VIH. El tercer mecanismo es la inactivación génica. Un ejemplo de inactivación génica es el uso de la mutagénesis por inserción para insertar un retrovirus que altera el genoma de la célula T en pacientes con leucemia y les proporciona un antígeno específico llamado CAR, lo que permite a las células T atacar las células cancerosas. El último mecanismo se denomina sustitución del extremo 3' del ARNm. Los genes humanos sufren ocasionalmente mutaciones puntuales que causan beta-talasemia, una afección que interrumpe la función de los glóbulos rojos . Para corregir este problema, se introduce la secuencia genética correcta para los glóbulos rojos y se realiza una sustitución. ^{[ 5 ]}

La recombinación homóloga puede utilizarse para producir mutaciones específicas en un organismo. Se introduce en la célula un vector que contiene una secuencia de ADN similar al gen que se desea modificar, y mediante un proceso de recombinación, se reemplaza el gen diana en el cromosoma. Este método puede utilizarse para introducir una mutación o inactivar un gen, por ejemplo, en la producción de ratones knockout . ^{[ 29 ]}

Desde 2013, el desarrollo de la tecnología CRISPR -Cas9 ha permitido la introducción eficiente de diferentes tipos de mutaciones en el genoma de una amplia variedad de organismos. El método no requiere un sitio de inserción de transposón, no deja marcadores, y su eficiencia y simplicidad lo han convertido en el método preferido para la edición del genoma . ^{[ 30 ] [ 31 ]}

A medida que disminuye el costo de la síntesis de oligonucleótidos de ADN, la síntesis artificial de un gen completo se ha convertido en un método viable para introducir mutaciones en un gen. Este método permite una mutación extensa en múltiples sitios, incluyendo el rediseño completo del uso de codones de un gen para optimizarlo para un organismo en particular. ^{[ 32 ]}

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