Microscopía de contraste de interferencia diferencial

La microscopía de contraste de interferencia diferencial ( DIC ) , también llamada contraste de interferencia de Nomarski ( NIC ) o microscopía de Nomarski , es una técnica de microscopía óptica que se utiliza para mejorar el contraste en muestras transparentes sin teñir . La DIC funciona según el principio de interferometría para obtener información sobre la longitud del camino óptico de la muestra y así visualizar características que de otro modo serían invisibles. Un sistema óptico relativamente complejo produce una imagen donde el objeto aparece de negro a blanco sobre un fondo gris. Esta imagen es similar a la obtenida mediante microscopía de contraste de fase , pero sin el halo de difracción brillante. La técnica fue inventada por Francis Hughes Smith. ^{[ 1 ] [ 2 ]} El "Smith DIK" fue fabricado por Ernst Leitz Wetzlar en Alemania y su producción era compleja. Posteriormente, el físico polaco Georges Nomarski desarrolló aún más la DIC en 1952. ^{[ 3 ]}

La técnica DIC funciona separando una fuente de luz polarizada en dos partes mutuamente coherentes y polarizadas ortogonalmente , que se desplazan espacialmente (se deforman) en el plano de la muestra y se recombinan antes de la observación. La interferencia de las dos partes durante la recombinación es sensible a su diferencia de trayectoria óptica (es decir, el producto del índice de refracción y la longitud geométrica de la trayectoria). Al añadir una fase de compensación ajustable que determina la interferencia en la diferencia de trayectoria óptica cero en la muestra, el contraste es proporcional al gradiente de longitud de trayectoria a lo largo de la dirección de deformación, lo que da la apariencia de un relieve físico tridimensional que corresponde a la variación de la densidad óptica de la muestra, enfatizando líneas y bordes, aunque sin proporcionar una imagen topográficamente precisa.

1. La luz no polarizada entra en el microscopio y se polariza a 45°.

Para que esta técnica funcione, se requiere luz polarizada.

2. La luz polarizada entra en el primer prisma de Wollaston modificado de Nomarski y se separa en dos rayos polarizados a 90° entre sí, los rayos de muestreo y de referencia.

Los prismas de Wollaston son un tipo de prisma compuesto por dos capas de una sustancia cristalina, como el cuarzo, que, debido a la variación del índice de refracción según la polarización de la luz, la descompone en función de dicha polarización. El prisma de Nomarski hace que los dos rayos converjan en un punto focal fuera del cuerpo del prisma, lo que permite una mayor flexibilidad al configurar el microscopio, ya que el prisma puede enfocarse activamente.

3. Los dos rayos son enfocados por el condensador para su paso a través de la muestra. Estos dos rayos se enfocan de manera que pasen por dos puntos adyacentes en la muestra,  separados por aproximadamente 0,2 μm.

La muestra se ilumina eficazmente mediante dos fuentes de luz coherente , una con polarización de 0° y la otra con polarización de 90°. Sin embargo, estas dos iluminaciones no están perfectamente alineadas, ya que una se encuentra ligeramente desplazada con respecto a la otra.

4. Los rayos viajan a través de áreas adyacentes de la muestra, separadas por la cizalladura. La separación suele ser similar a la resolución del microscopio. Experimentarán diferentes longitudes de trayectoria óptica donde las áreas difieren en índice de refracción o espesor. Esto provoca un cambio de fase de un rayo con respecto al otro debido al retardo que experimenta la onda en el material ópticamente más denso.

El paso de múltiples pares de rayos a través de pares de puntos adyacentes en la muestra (y su absorción, refracción y dispersión por la muestra) implica que la imagen de la muestra será captada tanto por la luz polarizada a 0° como a 90°. Si se observaran individualmente, estas serían imágenes de campo claro de la muestra, ligeramente desplazadas entre sí. La luz también transporta información sobre la imagen, invisible para el ojo humano: la fase de la luz. Esto es fundamental más adelante. Las diferentes polarizaciones evitan la interferencia entre estas dos imágenes en este punto.

5. Los rayos viajan a través de la lente del objetivo y se enfocan en el segundo prisma de Wollaston modificado de Nomarski.

6. El segundo prisma recombina los dos rayos en uno polarizado a 135°. La combinación de los rayos produce interferencia , aclarando u oscureciendo la imagen en ese punto según la diferencia de trayectoria óptica.

Este prisma superpone las dos imágenes de campo claro y alinea sus polarizaciones para que interfieran. Sin embargo, las imágenes no coinciden del todo debido al desfase en la iluminación; esto significa que, en lugar de que la interferencia se produzca entre dos rayos de luz que pasan por el mismo punto de la muestra, se produce entre rayos de luz que pasan por puntos adyacentes , los cuales, por lo tanto, tienen una fase ligeramente diferente. Dado que la diferencia de fase se debe a la diferencia en la longitud del camino óptico, esta recombinación de la luz provoca una " diferenciación óptica " de la longitud del camino óptico, generando la imagen observada.

La imagen presenta la apariencia de un objeto tridimensional bajo una iluminación muy oblicua, lo que provoca fuertes contrastes de luz y sombra en las caras correspondientes. La dirección de la iluminación aparente está definida por la orientación de los prismas de Wollaston.

Como se explicó anteriormente, la imagen se genera superponiendo dos imágenes idénticas de campo claro con un ligero desfase (normalmente de unos 0,2 μm). La interferencia resultante, debida a la diferencia de fase, convierte los cambios de fase (y, por lo tanto, de longitud del recorrido óptico) en un cambio visible de oscuridad. Esta interferencia puede ser constructiva o destructiva, dando lugar a la característica apariencia tridimensional.

La diferencia de fase típica que da lugar a la interferencia es muy pequeña, rara vez superior a 90° (un cuarto de la longitud de onda). Esto se debe a la similitud del índice de refracción de la mayoría de las muestras y los medios en los que se encuentran: por ejemplo, una célula en agua solo tiene una diferencia de índice de refracción de alrededor de 0,05. Esta pequeña diferencia de fase es importante para el correcto funcionamiento de la correlación digital de imágenes (DIC), ya que si la diferencia de fase en la unión entre dos sustancias es demasiado grande, podría alcanzar los 180° (media longitud de onda), lo que daría lugar a una interferencia destructiva completa y una región oscura anómala; si la diferencia de fase alcanzara los 360° (una longitud de onda completa), produciría una interferencia constructiva completa, creando una región brillante anómala.

La imagen se puede aproximar (despreciando la refracción y la absorción debidas a la muestra y el límite de resolución de la separación del haz) como la derivada de la longitud del camino óptico con respecto a la posición a través de la muestra a lo largo del corte, y por lo tanto la derivada del índice de refracción (densidad óptica) de la muestra.

El contraste se puede ajustar mediante la fase de compensación, ya sea desplazando el prisma de Nomarski del objetivo o mediante una lámina de onda lambda/4 entre el polarizador y el prisma de Nomarski del condensador (compensación de De-Senarmont). El contraste resultante varía desde campo oscuro para una fase de compensación cero (intensidad proporcional al cuadrado de la diferencia de cizallamiento), hasta el relieve típico observado para fases de ~5 a 90 grados, y finalmente, la tinción óptica a 360 grados, donde la longitud de onda extinguida se desplaza con la diferencia de fase.

Cuando se recopilan imágenes desplazadas secuencialmente, el desplazamiento de fase introducido por el objeto se puede desacoplar de los artefactos no interferométricos no deseados, lo que generalmente resulta en una mejora del contraste, especialmente en muestras turbias. ^{[ 4 ]}

La DIC se utiliza para obtener imágenes de muestras biológicas vivas y sin teñir, como un frotis de un cultivo de tejidos u organismos unicelulares individuales presentes en el agua. Debido a la iluminación espacialmente incoherente máxima, la resolución teórica se aproxima a la cobertura máxima teórica dictada por la esfera de Ewald . ^{[ 5 ]} Esto supone una mejora con respecto a los métodos que requieren un mayor grado de coherencia, como el contraste de fase .

Un área no biológica donde se utiliza la correlación digital de imágenes (DIC) es en el análisis del procesamiento de semiconductores de silicio planares. Las  películas delgadas (típicamente de 100 a 1000 nm) en el procesamiento de silicio suelen ser prácticamente transparentes a la luz visible (por ejemplo, dióxido de silicio, nitruro de silicio y silicio policristalino), y los defectos o la contaminación que se encuentra sobre ellas se vuelven más visibles. Esto también permite determinar si una característica es una cavidad en el material del sustrato o una acumulación de material extraño en la superficie. Las estructuras cristalinas grabadas adquieren una apariencia particularmente llamativa bajo la DIC.

La calidad de imagen, cuando se utiliza en condiciones adecuadas, ofrece una resolución excepcional. Sin embargo, el análisis de las imágenes DIC siempre debe tener en cuenta la orientación de los prismas de Wollaston y la dirección aparente de la luz, ya que las características paralelas a esta no serán visibles. No obstante, esto se soluciona fácilmente girando la muestra y observando los cambios en la imagen.

• Microscopía de interferencia clásica
• Microscopía Nanovid

• Murphy, D., Microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopía de contraste de modulación, en Fundamentos de microscopía óptica e imágenes digitales, Wiley-Liss, Nueva York, págs.  153–168 (2001).
• Salmon, E. y Tran, P., Microscopio óptico de contraste de interferencia diferencial mejorado por vídeo de alta resolución (VE-DIC), Microscopía de vídeo, Sluder, G. y Wolf, D. (eds), Academic Press, Nueva York, págs.  153–184 (1998).
• Contraste de interferencia diferencial — referencias

• Introducción al contraste de interferencia diferencial
• Contraste de interferencia diferencial Archivado el 25/07/2020 en Wayback Machine
• Microscopía DIC de luz reflejada
• Guía para la técnica de contraste de interferencia diferencial (DIC)