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Microscopía computacional

CDI: Una onda coherente ilumina una muestra y el detector registra un patrón de difracción sobremuestreado. La microscopía computacional combina iluminación personalizada, dispe...

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CDI: Una onda coherente ilumina una muestra y el detector registra un patrón de difracción sobremuestreado.

La microscopía computacional combina iluminación personalizada, dispersión coherente y reconstrucción algorítmica para generar imágenes cuantitativas 2D y 3D que abarcan escalas de longitud desde angstroms hasta centímetros. El campo unifica los principios de la microscopía y la cristalografía al reemplazar o aumentar los componentes ópticos con recuperación de fase y algoritmos computacionales. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] Los enfoques principales incluyen imágenes difractivas coherentes (CDI), pticografía (rayos X y electrones) y pticografía de Fourier (óptica). Juntos logran una resolución espacial récord , amplios campos de visión y contraste de fase cuantitativo en aplicaciones que van desde materiales y sistemas cuánticos hasta imágenes biológicas y metrología de dispositivos .

Definición y alcance

CDI ptychográfica de rayos X. Una sonda de rayos X realiza un barrido raster sobre una muestra extensa, con cada sonda superponiéndose a las adyacentes, y un detector registra el patrón de difracción en cada posición de barrido.

La microscopía computacional se refiere a modalidades de imagen en las que las mediciones brutas (a menudo patrones de difracción o pilas de imágenes bajo diversas iluminaciones) se transforman en funciones de transmisión de la muestra (amplitud y fase) mediante reconstrucción iterativa o aprendida. En comparación con la microscopía convencional, que utiliza lentes específicas para longitudes de onda, los métodos computacionales pueden (i) eliminar las aberraciones de la lente algorítmicamente, (ii) aumentar el producto espacio-ancho de banda (SBP) en órdenes de magnitud y (iii) proporcionar mapas cuantitativos de deformación, densidad electrónica , índice de refracción o magnetización . [ 1 ]

Historia

Los fundamentos iniciales de la microscopía computacional se remontan a la solución del problema de fase en cristalografía y óptica , y al desarrollo de algoritmos iterativos basados ​​en Fourier para la recuperación de fase. En 1972, Gerchberg y Saxton introdujeron el primer algoritmo iterativo práctico para recuperar información de fase a partir de datos de difracción y del plano de imagen. [ 6 ] Entre 1978 y 1982, Fienup perfeccionó este enfoque desarrollando algoritmos de reducción de errores y de entrada-salida híbridos, que se han utilizado ampliamente en la recuperación iterativa de fase. [ 7 ] [ 8 ]

En 1998, Miao, Sayre y Chapman introdujeron el concepto de la relación de sobremuestreo para la recuperación de fase, [ 9 ] que posteriormente se generalizó a la relación de sobredeterminación (α o = M/N), donde M y N denotan el número de puntos de datos medidos independientemente y variables de objeto desconocidas, respectivamente. [ 1 ] Cuando α o es sustancialmente mayor que uno, la información de fase está, en principio, codificada de forma única dentro de las intensidades de difracción medidas y puede recuperarse de forma determinista mediante algoritmos de reconstrucción iterativos .

En 1999, Miao y sus colegas extendieron experimentalmente la metodología cristalográfica a muestras no cristalinas, inaugurando la CDI como una técnica de imagen sin lentes. [ 10 ]

En 2007, Rodenburg y colaboradores demostraron la pticografía moderna con rayos X duros mediante el escaneo de una sonda coherente a través de una muestra extensa y la reconstrucción iterativa de la función de transmisión del objeto, asumiendo una sonda conocida. [ 11 ] En 2008, Thibault et al. demostraron la reconstrucción simultánea de las funciones de transmisión de la sonda y del objeto a partir de patrones de difracción superpuestos, estableciendo la pticografía como un método de imagen cuantitativo y general de alta resolución. [ 12 ]

En 2013, Zheng, Horstmeyer y Yang extendieron estos principios a la microscopía óptica con pticografía de Fourier, lo que permitió la obtención de imágenes de fase cuantitativas a escala de gigapíxeles en microscopios de sobremesa. [ 13 ]

Los avances posteriores en fuentes coherentes, detectores y algoritmos han establecido la microscopía computacional como un marco unificado que abarca modalidades ópticas, de rayos X y electrónicas. [ 1 ]

Principios

Cuando un haz coherente de fotones o electrones interactúa con una muestra, los detectores registran solo las intensidades de difracción, mientras que la información de fase correspondiente se pierde, un desafío conocido como el problema de fase. La microscopía computacional reconstruye la función de transmisión compleja de la muestra al imponer consistencia entre los datos medidos y las restricciones físicas a través de la optimización iterativa. [ 1 ] Estos algoritmos suelen alternar entre el espacio real y el recíproco, empleando esquemas como proyecciones alternas, [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] el motor iterativo ptychográfico extendido (ePIE), [ 14 ] mapas de diferencia, [ 15 ] y máxima verosimilitud, [ 16 ] [ 17 ] y otros. [ 3 ] [ 2 ] [ 18 ] Recientemente, se han desarrollado enfoques basados ​​en aprendizaje profundo para inferir la fase faltante directamente a partir de patrones de difracción medidos, lo que permite reconstrucciones más rápidas y robustas. [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]

En comparación con los métodos basados ​​en lentes, la microscopía computacional (i) puede superar la resolución limitada por el objetivo mediante la apertura numérica sintética en la pticografía de Fourier o capturando la dispersión de alto ángulo en la pticografía; (ii) proporciona mapas cuantitativos de fase, deformación y densidad electrónica sin corrección de la función de transferencia de contraste; y (iii) permite la obtención de imágenes tridimensionales no destructivas de muestras gruesas y heterogéneas, como circuitos integrados y tejidos biológicos. Las limitaciones incluyen el daño por radiación en las modalidades de rayos X y electrones, las restricciones de profundidad de campo, el problema del "cono faltante" en las reconstrucciones ópticas 3D, los largos tiempos de adquisición para muestras dinámicas y las altas exigencias computacionales. [ 1 ]

Métodos

Imágenes difractivas coherentes (CDI)

Difracción de Bragg CDI. Se obtienen patrones de difracción alrededor de uno o varios picos de Bragg a partir de un nanocristal.

CDI registra patrones de difracción de campo lejano sobremuestreados y reconstruye la función de transmisión compleja del objeto mediante recuperación de fase iterativa. CDI se puede implementar en varias configuraciones, incluyendo CDI convencional (dispersión frontal de objetos aislados), [ 10 ] CDI de Bragg (mapeo de la deformación de la red en nanocristales), [ 23 ] CDI de reflexión o incidencia rasante (sensibilidad de superficie e interfaz), [ 24 ] CDI de Fresnel (usando iluminación curva), [ 25 ] imágenes de modulación coherente (mejora de la recuperación de fase con un modulador conocido), [ 26 ] y CDI holográfica (combinando holografía con reconstrucción iterativa). [ 27 ]

La CDI se ha realizado utilizando una amplia gama de sondas coherentes, incluyendo radiación sincrotrón , láseres de electrones libres de rayos X (XFEL), generación de armónicos de alto orden (XUV/EUV) y electrones. [ 1 ] Los experimentos de CDI de pulso único con XFEL permiten la "difracción antes de la destrucción", capturando información estructural antes de que ocurra el daño por radiación. [ 28 ]

Ptychografía moderna (rayos X y electrones)

Ptychografía electrónica. Un haz de electrones enfocado escanea la muestra, recogiendo una serie de patrones de difracción de regiones parcialmente superpuestas.

La pticografía moderna realiza barridos rasterizados con una sonda coherente confinada a través de una cuadrícula superpuesta de posiciones y reconstruye iterativamente la función de transmisión del objeto a partir de los patrones de difracción resultantes. La redundancia creada por la superposición espacial, combinada con el sobremuestreo en el espacio recíproco, conduce a una rápida convergencia, alta estabilidad y recuperación cuantitativa de la fase. [ 1 ] [ 2 ]

En el régimen de rayos X, la pticografía permite la obtención de imágenes cuantitativas de muestras extensas con resolución a escala nanométrica y se ha convertido en una técnica fundamental en instalaciones de sincrotrón y láser de electrones libres. [ 29 ] [ 4 ] En microscopía electrónica (4D-STEM), la pticografía ha superado la resolución de la microscopía electrónica de transmisión con corrección de aberraciones, alcanzando límites de información sub- ångström —hasta aproximadamente 0,23 Å utilizando reconstrucción multicapa— y ofrece una alta eficiencia de dosis para materiales sensibles a la radiación y de elementos ligeros. [ 30 ] [ 31 ]

Ptychografía de Fourier (óptica)

Ptychografía de Fourier. Una matriz de LED ilumina la muestra desde múltiples ángulos, capturando una serie de imágenes de baja apertura numérica (NA) que abarcan diferentes regiones del espectro de Fourier. La recuperación de fase computacional las combina en una imagen de alta NA con contraste de fase cuantitativo.

La pticografía de Fourier (FP) sintetiza una pupila de alta apertura numérica (NA) variando el ángulo de iluminación —normalmente mediante matrices de LED programables— y uniendo computacionalmente los espectros de Fourier correspondientes. Este proceso amplía enormemente el producto espacio-ancho de banda (SBP), logrando imágenes a escala de gigapíxeles con contraste de fase cuantitativo. [ 13 ]

La FP permite la obtención de imágenes de fase cuantitativas sin marcadores con reenfoque digital y puede extenderse a tres dimensiones mediante tomografía de difracción y modelos de reconstrucción multicorte. Estos avances establecieron la pticografía de Fourier como un método computacional para la obtención de imágenes de fase cuantitativas para microscopía óptica de campo amplio y alta resolución en aplicaciones biológicas, biomédicas y de materiales. [ 5 ] [ 1 ]

Tomografía e imágenes 3D

Los algoritmos de reconstrucción iterativos basados ​​en restricciones, adaptados de la recuperación de fase, han permitido que la tomografía electrónica atómica (AET) alcance una resolución atómica 3D sin asumir cristalinidad. La primera demostración alcanzó una resolución de 2,4 Å, resolviendo átomos individuales directamente a partir de series de inclinación experimentales. [ 32 ] Desarrollos posteriores localizaron coordenadas atómicas con precisión de picómetros y determinaron las estructuras atómicas 3D de sólidos amorfos , revelando el orden de corto y medio alcance y proporcionando una base para estudios cuantitativos de la química local, la deformación y los defectos en materiales complejos. [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ]

La integración de la pticografía con la AET, conocida como tomografía electrónica atómica pticográfica (pAET), ofrece una vía de dosis eficiente para determinar las posiciones 3D de átomos ligeros y materiales sensibles a la radiación con precisión atómica. [ 37 ] [ 38 ] Más allá de los electrones, la CDI y la pticografía se han extendido a la tomografía de rayos X y la laminografía, lo que permite la obtención de imágenes 3D no destructivas de nanomateriales , texturas magnéticas, circuitos integrados y muestras biológicas con contraste de fase cuantitativo y resolución a escala nanométrica. [ 1 ]

Aplicaciones

Materiales cuánticos y magnéticos

La tomografía ptychográfica vectorial combinada con el dicroísmo magnético de rayos X permite el mapeo tridimensional de texturas de espín —como puntos de Bloch, erizos y skyrmiones— con resoluciones espaciales de aproximadamente 10–100 nm. Estas técnicas proporcionan información cuantitativa sobre los componentes vectoriales de la magnetización y se han utilizado para revelar la topología e interacciones de monopolos magnéticos a nanoescala en metalredes ferromagnéticas . [ 39 ] [ 40 ] Las implementaciones resueltas en el tiempo que utilizan esquemas de bombeo-sonda han capturado además la dinámica de magnetización ultrarrápida en la escala de tiempo de picosegundos, ofreciendo información sobre los procesos de espín fuera del equilibrio en materiales cuánticos y magnéticos. [ 1 ]

Materiales energéticos e imágenes operando

La imagen difractiva coherente de Bragg in situ (BCDI) permite el mapeo tridimensional del desplazamiento de la red y la deformación en los cátodos de las baterías durante el ciclo electroquímico, revelando vías de acumulación de deformación a nanoescala que impulsan la degradación estructural y la pérdida de voltaje en óxidos laminares ricos en Li y Mn. [ 41 ] La pticografía-espectroscopia-tomografía correlativa amplía estas mediciones al cuantificar la evolución acoplada de la estructura, la química y los estados de oxidación en tres dimensiones, proporcionando información mecanicista sobre los procesos de degradación electroquímica a nanoescala. [ 1 ]

Nanomateriales y dinámica ultrarrápida

La CDI y la pticografía permiten la obtención de imágenes tridimensionales cuantitativas de la evolución de defectos, la dinámica de granos y el orden de superredes en nanomateriales con resoluciones espaciales de aproximadamente 7–15 nm. Estos métodos han revelado la estructura interna y el desorden de los conjuntos de nanopartículas y las estructuras multimateriales con precisión cuantitativa. [ 42 ] Los experimentos con XFEL de femtosegundos extienden estas capacidades al dominio temporal, capturando la evolución de la forma de partículas individuales, el movimiento de la red y la fusión en escalas de tiempo de picosegundos, lo que proporciona información sobre la dinámica estructural de no equilibrio a nanoescala. [ 1 ]

Circuitos integrados y metrología de dispositivos

La tomografía y la laminografía de rayos X pticográficas proporcionan metrología tridimensional no destructiva de circuitos integrados avanzados, resolviendo estructuras a nanoescala como compuertas, aletas e interconexiones dentro de chips CMOS comerciales . [ 43 ] Los avances recientes en pticografía de ráfaga y reenfoque digital han logrado una resolución de medio paso de 4,2 nm en un CI de nodo de 7 nm al tiempo que extienden el campo de visión y el rendimiento de adquisición, estableciendo la pticografía de rayos X como una herramienta poderosa para la caracterización cuantitativa de dispositivos y el análisis de fallas. [ 44 ]

Biología y biomedicina

La pticografía óptica de Fourier (FP) permite la obtención de imágenes de fase cuantitativas y sin marcadores de tejidos y células con productos espacio-ancho de banda a escala de gigapíxeles y reconstrucciones tridimensionales mediante tomografía de difracción, eliminando la necesidad de escaneos Z mecánicos. [ 5 ] La pticografía de rayos X de muestras biológicas congeladas e hidratadas revela detalles ultraestructurales y, cuando se combina con la fluorescencia de rayos X , permite el mapeo correlativo de distribuciones elementales en tres dimensiones. [ 45 ] [ 46 ]

La pticografía electrónica criogénica ha alcanzado recientemente una resolución subnanométrica en el análisis de partículas individuales y está emergiendo como una técnica complementaria a la tomografía crioelectrónica para muestras biológicas más gruesas, ofreciendo un contraste mejorado para materiales con baja dispersión e información cuantitativa de fase en amplios campos de visión. [ 47 ] [ 48 ] [ 1 ]

Instrumentación y detectores

Los detectores de matriz de píxeles híbridos en rayos X y los sensores EMPAD dedicados en microscopios electrónicos proporcionan un alto rango dinámico y velocidades de fotogramas rápidas adecuadas para CDI/pticografía; los detectores de integración de carga de próxima generación (por ejemplo, CITIUS) aceleran aún más la recopilación de datos y mejoran la relación señal/ruido. [ 1 ] [ 49 ] [ 50 ]

Direcciones futuras

Se espera que los futuros avances en microscopía computacional se centren en la automatización , la integración y la reconstrucción basada en datos. Los sistemas automatizados para la adquisición de datos, la recuperación de fase y la reconstrucción tomográfica optimizarán los flujos de trabajo y harán que la CDI y la pticografía sean más accesibles para personas no especializadas. Los avances en la recuperación de fase mediante aprendizaje profundo prometen acelerar la reconstrucción de imágenes al aprender mapeos directos entre patrones de difracción y estructuras de objetos, reduciendo la dependencia de algoritmos iterativos y permitiendo análisis a gran escala en tiempo real. [ 1 ]

A nivel metodológico, se prevé que la pticografía electrónica rutinaria sub-ångström y la tomografía electrónica atómica pticográfica de dosis eficiente (pAET) permitan la obtención de imágenes atómicas tridimensionales de elementos ligeros y materiales sensibles a la radiación con una precisión sin precedentes. El desarrollo continuo de la CDI in situ de baja dosis, que aprovecha la interferencia coherente entre componentes estáticos y dinámicos, puede reducir el daño por radiación en varios órdenes de magnitud. Mientras tanto, la CDI de rayos X de resolución atómica en fuentes de sincrotrón de cuarta generación podría extender la obtención de imágenes a escala atómica a muestras más gruesas y proporcionar un contraste químico y magnético complementario. En el régimen óptico, la pticografía de Fourier integrada con modalidades de fluorescencia y superresolución está preparada para transformar la obtención de imágenes de fase cuantitativas en patología digital clínica, mientras que los paquetes de software especializados y los marcos de análisis automatizados ampliarán aún más su adopción en diversas disciplinas. [ 1 ]

Referencias

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