Problema de fase

Si el cristal difracta a alta resolución (<1,2 Å), las fases iniciales pueden estimarse mediante métodos directos. ^{[ 1 ]} Los métodos directos pueden utilizarse en cristalografía de rayos X , ^{[ 1 ]} cristalografía de neutrones , ^{[ 7 ]} y cristalografía electrónica . ^{[ 4 ] [ 5 ]}

Mediante este método se prueban y seleccionan varias fases iniciales. El otro método es el de Patterson, que determina directamente las posiciones de los átomos pesados. La función de Patterson proporciona un valor elevado en una posición que corresponde a vectores interatómicos. Este método solo se puede aplicar cuando el cristal contiene átomos pesados ​​o cuando ya se conoce una fracción significativa de su estructura.

Para moléculas cuyos cristales presentan reflexiones en el rango sub-Ångström, es posible determinar las fases mediante métodos de fuerza bruta , probando una serie de valores de fase hasta observar estructuras esféricas en el mapa de densidad electrónica resultante. Esto funciona porque los átomos tienen una estructura característica cuando se observan en el rango sub-Ångström. La técnica está limitada por la capacidad de procesamiento y la calidad de los datos. En la práctica, se limita a moléculas pequeñas y péptidos, ya que estos proporcionan de forma consistente una difracción de alta calidad con muy pocas reflexiones.

Las fases también pueden inferirse mediante un proceso denominado reemplazo molecular , en el que las fases ya conocidas de una molécula similar se injertan en las intensidades de la molécula en cuestión, determinadas observacionalmente. Estas fases pueden obtenerse experimentalmente a partir de una molécula homóloga o, si se conocen las fases de la misma molécula pero en un cristal diferente, simulando el empaquetamiento de la molécula en el cristal y obteniendo fases teóricas. En general, estas técnicas son menos deseables, ya que pueden sesgar considerablemente la solución de la estructura. Sin embargo, son útiles para estudios de unión de ligandos o entre moléculas con pequeñas diferencias y estructuras relativamente rígidas (por ejemplo, la derivatización de una molécula pequeña).

En muchos casos, se determina un conjunto inicial de fases y se calcula el mapa de densidad electrónica para el patrón de difracción. Luego, el mapa se utiliza para determinar porciones de la estructura, las cuales se utilizan para simular un nuevo conjunto de fases. Este nuevo conjunto de fases se conoce como refinamiento . Estas fases se vuelven a aplicar a las amplitudes originales y se obtiene un mapa de densidad electrónica mejorado, a partir del cual se corrige la estructura. Este proceso se repite hasta que un término de error (generalmente${\displaystyle R_{\textrm {libre}}}$) se ha estabilizado a un valor satisfactorio. Debido al fenómeno del sesgo de fase , es posible que una asignación inicial incorrecta se propague a través de refinamientos sucesivos, por lo que las condiciones satisfactorias para una asignación de estructura siguen siendo objeto de debate. De hecho, se han reportado algunas asignaciones incorrectas espectaculares, incluyendo una proteína en la que toda la secuencia se enhebró hacia atrás. ^{[ 8 ]}