Proteína de reparación del ADN XRCC4

El daño al ADN ocurre con mucha frecuencia y se genera por la exposición a una variedad de fuentes genotóxicas tanto exógenas como endógenas. ^{[ 11 ]} Una de estas incluye la radiación ionizante , como la radiación gamma y los rayos X , que ionizan los grupos desoxirribosa en la cadena principal del ADN y pueden inducir roturas de doble cadena (DSB). ^{[ 8 ]} Las especies reactivas de oxígeno (ROS), como el superóxido (O ₂ ^{– •}  ), el peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ ), los radicales hidroxilo (HO ^• ) y el oxígeno singlete ( ¹ O ₂ ), también pueden producir DSB como resultado de la radiación ionizante, así como de los procesos metabólicos celulares que ocurren naturalmente. ^{[ 13 ]} Las DSB también pueden ser causadas por la acción de la ADN polimerasa al intentar replicar el ADN sobre una muesca introducida como resultado del daño al ADN. ^{[ 8 ] [ 11 ]}

Existen muchos tipos de daño en el ADN , pero las roturas de doble cadena (DSB, por sus siglas en inglés) son, en particular, las más dañinas, ya que ambas hebras se separan completamente del resto del cromosoma . Si no existe un mecanismo de reparación eficiente, los extremos del ADN pueden degradarse, lo que conlleva una pérdida permanente de la secuencia. ^{[ 8 ]} Una brecha de doble cadena en el ADN también impide la replicación , lo que resulta en una copia incompleta de ese cromosoma específico y predispone a la célula a la apoptosis . Al igual que con todos los daños en el ADN, las DSB pueden introducir nuevas mutaciones que, en última instancia, pueden provocar cáncer . ^{[ 8 ] [ 11 ]}

Existen dos métodos para reparar las roturas de doble cadena (DSB) dependiendo del momento en que se produzca el daño durante la mitosis . ^{[ 6 ]} Si la DSB se produce después de que la replicación del ADN haya finalizado, durante la fase S del ciclo celular , la vía de reparación de DSB utilizará la recombinación homóloga mediante el apareamiento con la cadena hija recién sintetizada para reparar la rotura. Sin embargo, si la DSB se genera antes de la síntesis del cromosoma hermano, la secuencia plantilla necesaria estará ausente. ^{[ 8 ]} En este caso, la vía NHEJ proporciona una solución para reparar la rotura y es el principal sistema utilizado para reparar las DSB en humanos y eucariotas multicelulares. ^{[ 6 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 13 ]} Durante la NHEJ, segmentos muy cortos de ADN complementario, de uno o más pares de bases a la vez, se hibridan entre sí y se eliminan los extremos sobresalientes. Como resultado, esta región específica del genoma se pierde permanentemente y la deleción puede provocar cáncer y envejecimiento prematuro. ^{[ 8 ] [ 12 ]}

XRCC4 se encuentra en el cromosoma 5 , específicamente en 5q14.2. Este gen contiene ocho exones y tres variantes de transcripción de ARNm , que codifican dos isoformas proteicas diferentes . La variante de transcripción 1, ARNm, RefSeq NM_003401.3, tiene 1688 pb de longitud y es la más corta de las tres variantes. Le falta una secuencia corta en la región codificante 3' en comparación con la variante 2. La isoforma 1 contiene 334 aminoácidos . La variante de transcripción 2, ARNm, RefSeq NM_022406, tiene 1694 pb de longitud y codifica la isoforma 2 más larga, que contiene 336 aminoácidos . La variante de transcripción 3, RefSeq NM_022550.2, tiene 1735 pb y es la más larga, pero también codifica la misma isoforma 1 que la variante 1. Contiene una secuencia adicional en la región 5'UTR del transcrito de ARNm y carece de una secuencia corta en la región codificante 3' en comparación con la variante 2. ^{[ 14 ]}

hXRCC4 es un tetrámero con forma de mancuerna, compuesto por dos extremos globulares separados por un tallo largo y delgado. El tetrámero está formado por dos dímeros , y cada dímero está compuesto por dos subunidades similares . La primera subunidad (L) contiene los residuos de aminoácidos 1–203 y tiene un tallo más largo que la segunda subunidad (S), que contiene los residuos 1–178.

Los dominios globulares N-terminales de cada subunidad son idénticos. Están formados por dos láminas beta antiparalelas que se enfrentan en una estructura tipo sándwich beta (es decir, un barril beta aplanado ) y están separadas por dos hélices alfa en un lado. El extremo N comienza con una lámina beta compuesta por las hebras 1, 2, 3 y 4, seguida de un motivo hélice-giro-hélice de las dos hélices alfa, αA y αB, que continúa en las hebras 5, 6 y 7, y termina con un tallo de hélice alfa en el extremo C. αA y αB son perpendiculares entre sí, y debido a que un extremo de αB se inserta parcialmente entre las dos láminas beta, provoca que se separen. La estructura de sándwich beta se mantiene unida mediante tres enlaces de hidrógeno entre las hebras antiparalelas 4 y 7 y un enlace de hidrógeno entre las hebras 1 y 5.

Los dos tallos helicoidales entre las subunidades L y S se entrelazan con un único cruce levógiro formando una estructura de hélice enrollada en la parte superior, cerca de los dominios globulares, creando una configuración similar a la de una palmera. Esta región interactúa con las dos hélices alfa del segundo dímero en una orientación opuesta para formar un haz de cuatro hélices y el tetrámero con forma de mancuerna. ^{[ 15 ]}

Para que hXRCC4 sea secuestrada del citoplasma al núcleo para reparar una rotura de doble cadena (DSB) durante la NHEJ o para completar la recombinación V(D)J , se requiere una modificación postraduccional en la lisina 210 con un modificador pequeño relacionado con la ubiquitina (SUMO), o sumoilación . La modificación por SUMO de diversos tipos de proteínas de reparación del ADN se puede encontrar en topoisomerasas , glicosilasa de escisión de bases TDG, Ku70/80 y helicasa BLM . Un motivo conservado común que suele ser un objetivo de la modificación por SUMO es ΨKXE (donde Ψ es un aminoácido voluminoso e hidrofóbico ). En el caso de la proteína XRCC4, la secuencia consenso que rodea la lisina 210 es IKQE. Las células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan la forma mutada de XRCC4 en K210 no pueden ser modificadas con SUMO, no se reclutan al núcleo y, en cambio, se acumulan en el citoplasma. Además, estas células son sensibles a la radiación y no completan con éxito la recombinación V(D)J. ^{[ 7 ]}

Tras la generación de una rotura de doble cadena (DSB), las proteínas Ku se desplazan por el citoplasma hasta encontrar el sitio de la rotura y unirse a él. ^{[ 16 ]} Ku recluta a XRCC4 y Cer-XLF , y ambas proteínas interactúan cooperativamente entre sí a través de residuos específicos para formar un complejo de poro nucleoproteico que envuelve el ADN. Cer-XLF es un homodímero muy similar a XRCC4 en la estructura y el tamaño de sus dominios N-terminal y C-terminal . Los residuos arginina 64, leucina 65 y leucina 115 de Cer-XLF interactúan con las lisinas 65 y 99 de XRCC4 dentro de sus dominios N-terminales. Juntos forman un haz de filamentos que envuelve el ADN en un patrón alterno. La hiperfosforilación de los dominios alfa helicoidales C-terminales de XRCC4 por DNA-PKcs facilita esta interacción. El dímero XRCC4 se une a un segundo dímero en una hebra de ADN adyacente para crear un tetrámero que forma un puente de ADN al inicio de la NHEJ. Antes de la ligación , Lig IV se une al tallo C-terminal de XRCC4 en el sitio de la ruptura y desplaza al segundo dímero XRCC4. ^{[ 9 ]} El dominio BRCT2 de Lig IV forma enlaces de hidrógeno con XRCC4 en este dominio a través de múltiples residuos e introduce una torsión en las dos colas de hélice alfa. La pinza hélice-bucle-hélice conectada al conector BRCT también establece contactos extensos. ^{[ 17 ]}

El proceso NHEJ involucra a XRCC4 y varias proteínas estrechamente acopladas que actúan en conjunto para reparar la DSB. El sistema comienza con la unión de una proteína heterodimérica llamada Ku70/80 a cada extremo de la DSB para mantenerlas cerca una de la otra en preparación para la ligación y prevenir su degradación. ^{[ 8 ] [ 18 ]} Luego, Ku70/80 secuestra una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN (DNA-PKcs) a los extremos del ADN para permitir la unión de la proteína Artemis a un extremo de cada DNA-PKcs. ^{[ 8 ] [ 9 ] [ 17 ]} Un extremo de la DNA-PKcs se une para estabilizar la proximidad de la DSB y permitir que regiones muy cortas de complementariedad de ADN se hibriden. ^{[ 8 ] [ 9 ]} DNA-PKcs luego fosforila a Artemis en una serina / treonina para activar su actividad exonucleasa y escindir nucleótidos en las colas de cadena simple que no están hibridados en una dirección de 5' a 3'. ^{[ 8 ] [ 17 ]} Dos proteínas XRCC4 son modificadas postraduccionalmente para el reconocimiento y localización en Ku70/80 (5). Las dos proteínas XRCC4 se dimerizan juntas y se unen a Ku70/80 en los extremos de las cadenas de ADN para promover la ligación. XRCC4 luego forma un complejo fuerte con la ADN ligasa IV, LigIV, que es potenciado por el factor Cernunnos similar a XRCC4, Cer-XLF. ^{[ 9 ] [ 17 ]} Cer-XLF solo se une a XRCC4 sin interacción directa con LigIV. LigIV luego une los extremos del ADN catalizando un enlace fosfodiéster covalente . ^{[ 8 ] [ 17 ]}

La recombinación V(D)J es la reorganización de múltiples segmentos genéticos distintos en el ADN de la línea germinal para producir los dominios proteicos únicos de las células inmunitarias , células B y células T , que reconocerán específicamente antígenos extraños como virus , bacterias y eucariotas patógenos . Las células B producen anticuerpos que se secretan al torrente sanguíneo y las células T producen receptores que, una vez traducidos, se transportan a la bicapa lipídica externa de la célula. Los anticuerpos están compuestos por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. El sitio de unión al antígeno consta de dos regiones variables, VL y VH. El resto de la estructura del anticuerpo está formado por regiones constantes, CL, CH, CH2 y CH3. El locus Kappa en el ratón codifica una cadena ligera de anticuerpo y contiene aproximadamente 300 segmentos genéticos para la región variable, V, cuatro segmentos J que codifican una región proteica corta y un segmento constante, C. Para producir una cadena ligera con un tipo único de VL, durante la diferenciación de las células B, el ADN se reorganiza para incorporar una combinación única de los segmentos V y J. El empalme de ARN une la región recombinada con el segmento C. El gen de la cadena pesada también contiene numerosos segmentos de diversidad, D, y múltiples segmentos constantes, Cμ, Cδ, Cγ, Cε, Cα. La recombinación ocurre en una región específica del gen que se encuentra entre dos motivos de secuencia conservados llamados secuencias de señal de recombinación. Cada motivo está flanqueado por una secuencia de 7 pb y otra de 9 pb separadas por un espaciador de 12 pb, denominado clase 1, o un espaciador de 23 pb, denominado clase 2. Una recombinasa compuesta por las subunidades RAG1 y RAG2 siempre corta entre estos dos sitios. La escisión da como resultado dos estructuras en horquilla para los segmentos V y J, respectivamente, y la región no codificante, que ahora están separadas de los segmentos V y J por una DSB. La región codificante en horquilla pasa por el proceso de NHEJ donde el extremo cerrado se escinde y se repara. La región no codificante se circulariza y se degrada. ^{[ 6 ] [ 8 ]} Por lo tanto, NHEJ también es importante en el desarrollo del sistema inmunitario a través de su papel en la recombinación V(D)J. ^{[ 19 ]}

Los polimorfismos de XRCC4 se han vinculado a un riesgo de susceptibilidad a cánceres como el cáncer de vejiga , ^{[ 20 ]} cáncer de mama , ^{[ 21 ]} cáncer de próstata , carcinoma hepatocelular , linfomas y mieloma múltiple . ^{[ 22 ]} Con respecto al cáncer de vejiga, por ejemplo, el vínculo entre XRCC4 y el riesgo de susceptibilidad al cáncer se basó en estudios histológicos de casos y controles hospitalarios de variantes genéticas tanto de XRCC4 como de XRCC3 y su posible asociación con el riesgo de cáncer de vejiga urotelial. El vínculo con el riesgo de susceptibilidad al cáncer de vejiga urotelial se demostró para XRCC4, pero no para XRCC3 ^{[ 20 ]} Con respecto al cáncer de mama, el vínculo con "mayor riesgo de cáncer de mama" se basó en un examen de polimorfismos funcionales del gen XRCC4 realizado en conexión con un metaanálisis de cinco estudios de casos y controles. ^{[ 21 ]} También hay al menos un estudio histológico de casos y controles basado en un hospital que indica que los polimorfismos en XRCC4 pueden tener una "influencia" en la susceptibilidad al cáncer de próstata. ^{[ 23 ]} La deleción condicional (mediada por CD21-cre) del gen NHEJ XRCC4 en células B periféricas de ratón deficientes en p53 resultó en linfomas de células B Ig-negativas de superficie, y estos linfomas a menudo tenían una "translocación cromosómica recíproca" que fusionaba IgH con Myc (y también tenían "grandes deleciones o translocaciones cromosómicas" que involucraban IgK o IgL , con IgL "fusionándose" con oncogenes o con IgH). ^{[ 24 ]} Los linfomas pro-B deficientes en XRCC4 y p53 "activan rutinariamente c-myc por amplificación genética"; y además, los linfomas de células B periféricas deficientes en XRCC4 y p53 "activan ectópicamente de forma rutinaria" una sola copia de c-myc. ^{[ 24 ]} De hecho, en vista de la observación de algunos de que "las enzimas de reparación del ADN son correctoras del daño del ADN inducido por carcinógenos y fármacos anticancerígenos", ^{[ 25 ]} no debería sorprender que "los SNP en los genes de reparación del ADN puedan desempeñar un papel importante" en la susceptibilidad al cáncer. ^{[ 25 ]} Además de los cánceres identificados anteriormente, se ha identificado que los polimorfismos de XRCC4 tienen un vínculo potencial con varios cánceres adicionales, como el cáncer oral , el cáncer de pulmón , el cáncer gástrico ,ygliomas . ^{[ 25 ]}

La disminución de la capacidad para reparar roturas de doble cadena de ADN mediante NHEJ podría ser un factor importante en el proceso de envejecimiento . Li et al. ^{[ 26 ]} descubrieron que, en humanos, la eficiencia de la reparación NHEJ disminuye entre los 16 y los 75 años. Su estudio indicó que la menor expresión de XRCC4 y otras proteínas NHEJ impulsa una disminución de la eficiencia y la fidelidad de NHEJ asociada a la edad. Sugirieron que la disminución de la expresión de XRCC4 relacionada con la edad podría contribuir a la senescencia celular.

Basándose en los hallazgos de que (1) varios polipéptidos en la vía NHEJ son "objetivos potenciales de autoanticuerpos" y (2) "uno de los epítopos autoinmunes en XRCC4 coincide con una secuencia que es un nexo para eventos reguladores inducidos por radiación", se ha sugerido que la exposición a agentes que introducen roturas de doble cadena de ADN "puede ser uno de los factores" que median las respuestas autoinmunes. ^{[ 27 ] [ 28 ]}

Se ha especulado que "los genotipos y alelos relacionados con el codón 247*A de XRCC4 y el promotor -1394*T de XRCC4... podrían estar asociados con una mayor susceptibilidad y patogénesis de la endometriosis". ^{[ 29 ]}

En vista de las posibles asociaciones de los polimorfismos de XRCC4 con el riesgo de susceptibilidad al cáncer (véase la discusión anterior), XRCC4 podría utilizarse como biomarcador para la detección precoz del cáncer , en particular con respecto al cáncer de próstata, de mama y de vejiga. ^{[ 20 ]} De hecho, los polimorfismos de XRCC4 se identificaron específicamente como marcadores potencialmente útiles para la prevención primaria y la intervención anticancerígena en el caso del cáncer urotelial de vejiga. ^{[ 20 ]}

En vista del papel de XRCC4 en la reparación de roturas de doble cadena del ADN , se ha investigado la relación entre la disfunción de XRCC4 y la radiosensibilización de las células tumorales. Por ejemplo, se ha informado que "la focalización mediada por ARN de interferencia (ARNi ) de secuencias codificantes y no codificantes en los mensajes de genes de reparación del ADN radiosensibiliza eficazmente las células tumorales humanas". ^{[ 30 ]}

En la literatura se ha debatido sobre el papel potencial de XRCC4 en el desarrollo de nuevas terapias. Por ejemplo, Wu et al. han sugerido que, dado que el gen XRCC4 es "crítico en NHEJ" y está "asociado positivamente con la susceptibilidad al cáncer", algunos SNP de XRCC4, como G-1394T (rs6869366), "pueden servir como un SNP común para detectar y predecir varios tipos de cáncer (hasta ahora para cáncer de mama, gástrico y de próstata...)"; y, aunque se necesita más investigación, "pueden servir como objetivos candidatos para fármacos anticancerígenos personalizados". ^{[ 25 ]} También se ha mencionado la posibilidad de detectar la endometriosis sobre esta base, y esto también podría conducir al desarrollo de tratamientos. ^{[ 25 ] [ 29 ]} Al evaluar otras posibilidades para tratamientos anticancerígenos, Wu et al . también comentaron la importancia de los "tratamientos combinados de agentes que dañan el ADN y radiación". ^{[ 25 ]} Específicamente, Wu et al . Se señaló que el "equilibrio entre el daño al ADN y la capacidad de los mecanismos de reparación del ADN determina el resultado terapéutico final" y que "la capacidad de las células cancerosas para completar los mecanismos de reparación del ADN es importante para la resistencia terapéutica y tiene un impacto negativo en la eficacia terapéutica", y por lo tanto se teorizó que "[l]a inhibición farmacológica de objetivos de reparación del ADN recientemente detectados con varios compuestos de moléculas pequeñas... tiene el potencial de mejorar la citotoxicidad de los agentes anticancerígenos". ^{[ 25 ]}

En humanos, las mutaciones en el gen XRCC4 causan enanismo primordial microcefálico, un fenotipo caracterizado por microcefalia marcada, dismorfia facial, retraso del desarrollo y baja estatura. ^{[ 31 ]} Aunque la diversidad de la unión de inmunoglobulinas está alterada, estos individuos no muestran un fenotipo inmunológico reconocible. ^{[ 31 ] [ 32 ]} A diferencia de los individuos con una mutación LIG4, la pancitopenia que resulta en insuficiencia de la médula ósea no se observa en individuos con deficiencia de XRCC4. ^{[ 32 ]} A nivel celular, la alteración de XRCC4 induce hipersensibilidad a agentes que inducen roturas de doble cadena, reparación defectuosa de roturas de doble cadena y aumento de la apoptosis después de la inducción de daño en el ADN. ^{[ 31 ]}