Recuento de colonias virtuales

El recuento virtual de colonias ( VCC ) es un ensayo microbiológico cinético de 96 pocillos desarrollado originalmente para medir la actividad de las defensinas . ^{[ 1 ]} Desde entonces se ha aplicado a otros péptidos antimicrobianos, incluido el LL-37 . ^{[ 2 ]} Utiliza un método de enumeración de bacterias llamado cinética de crecimiento cuantitativa, que compara el tiempo que tarda un cultivo bacteriano en alcanzar una densidad óptica umbral con el de una serie de curvas de calibración. El nombre VCC también se ha utilizado para describir la aplicación de la cinética de crecimiento cuantitativa para enumerar bacterias en modelos de infección de cultivo celular . ^{[ 3 ]} Las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (AST) se pueden realizar en placas de 96 pocillos diluyendo el agente antimicrobiano a diferentes concentraciones en caldo inoculado con bacterias y midiendo la concentración mínima inhibitoria que no produce crecimiento. Sin embargo, estos métodos no se pueden utilizar para estudiar algunos péptidos antimicrobianos activos en la membrana , que son inhibidos por el propio caldo. El procedimiento de recuento virtual de colonias aprovecha este hecho al exponer primero las células bacterianas al agente antimicrobiano activo en un tampón de baja concentración salina durante dos horas, para luego inhibir simultáneamente la actividad antimicrobiana e inducir el crecimiento exponencial mediante la adición de caldo de cultivo. Posteriormente, se puede monitorizar la cinética de crecimiento de las células supervivientes utilizando un lector de placas con control de temperatura . El tiempo que tarda cada curva de crecimiento en alcanzar un umbral de cambio en la densidad óptica se convierte en valores de supervivencia virtual, que sirven como medida de la actividad antimicrobiana.

Existen métodos para probar la actividad antibacteriana de los agentes antimicrobianos desde hace décadas. ^{[ 4 ] [ 5 ]} Por lo general, estos métodos implican exponer las bacterias al agente antimicrobiano en presencia de nutrientes que, de otro modo, permitirían un crecimiento robusto de las bacterias. Los experimentos podían realizarse en placas que contenían agar como soporte sólido o en caldo líquido sin agar. ^{[ 6 ]} Muchos antibióticos de molécula pequeña se desarrollaron utilizando estos métodos. Sin embargo, surgió una complicación cuando los investigadores quisieron estudiar la actividad antibacteriana de algunos péptidos antimicrobianos, ya que estos se inhiben en medios ricos, ya sea que se suministren en una placa de agar o en caldo. Por ejemplo, las defensinas son péptidos antimicrobianos que forman parte del sistema inmunitario innato de muchos organismos, incluidos los humanos. Se dividen en varias clases estructurales, incluidas alfa, beta y theta, según el patrón de enlaces disulfuro. Cuatro defensinas alfa humanas se encuentran en los gránulos del neutrófilo y se conocen como péptidos de neutrófilos humanos (HNP) 1-4. En los inicios del estudio de las defensinas, se descubrió que las HNP se inhiben fuertemente por concentraciones fisiológicas de sal. Para medir la actividad antimicrobiana de las HNP, era necesario incubarlas con células en un tampón con baja concentración de sal como paso inicial, antes de añadir un medio de cultivo rico que permitiera la enumeración de las células supervivientes. Dado que no existe una forma de analizar péptidos como la defensina HNP1 en presencia de concentraciones de sal fisiológicamente relevantes, cualquier ensayo que mida la actividad de HNP1 utiliza condiciones diferentes a las presentes en el organismo.

Un método comúnmente empleado para medir la actividad antimicrobiana en líquido es exponer el agente antimicrobiano a las células durante un tiempo de incubación como dos horas, y luego enumerar los supervivientes diluyendo la mezcla y luego extendiendo una porción del líquido en una placa de agar que contiene un medio rico. ^{[ 2 ]} El paso de incubación se realiza comúnmente en una placa de 96 pocillos. Después de la siembra, las placas de agar se incuban durante la noche y el número de unidades formadoras de colonias (UFC) se cuenta al día siguiente. Estos métodos tienen una serie de inconvenientes, incluyendo la inexactitud introducida en el paso de dilución y la posibilidad de que se requiera un gran número de placas de agar para producir un número aceptable de colonias por placa. ^{[ 7 ]} Cabe señalar que para medir la actividad antimicrobiana de agentes antimicrobianos como las defensinas, el paso de incubación de dos horas se realizaría en un tampón de baja sal como fosfato de sodio 10 mM pH 7,4.

Otro método comúnmente empleado para medir la actividad antimicrobiana en líquido consiste en exponer series de dilución del agente antimicrobiano a células en un caldo rico como el caldo Mueller-Hinton (MHB) en una placa de 96 pocillos, y luego incubar la placa de 96 pocillos a 37  °C durante la noche. Cada pocillo se volverá turbio debido al crecimiento bacteriano o permanecerá transparente. La concentración mínima inhibitoria (CMI) se informa entonces como la concentración más baja que produce un pocillo transparente y, por lo tanto, inhibe el crecimiento. ^{[ 8 ]} Los métodos estandarizados de CMI que utilizan MHB no son aplicables a agentes antimicrobianos como las defensinas, porque las defensinas deben incubarse en un tampón de baja concentración salina, no en un caldo rico, para medir su actividad.

El método tradicional de recuento de colonias podría modificarse para medir la actividad antimicrobiana en placas de 96 pocillos sin necesidad de muestrear los pocillos ni sembrar las células supervivientes en placas de agar, simplemente añadiendo un volumen igual de caldo concentrado dos veces tras dos horas de incubación en el tampón de baja concentración salina. Sería necesario un método para determinar cuántas células sobrevivieron al final del periodo de incubación mediante cultivos por lotes. Afortunadamente, las matemáticas del crecimiento exponencial ofrecen una solución. Si se monitoriza en tiempo real la turbidez, o densidad óptica, de los cultivos por lotes en la placa de 96 pocillos, se registra el tiempo necesario para que un pocillo alcance un umbral y se conoce el tiempo de duplicación de las células en crecimiento exponencial, se puede calcular el número de células presentes inicialmente en el inóculo. Este número inicial de células es igual al número de células supervivientes al final de las dos horas de incubación con el agente antimicrobiano. Dado que este procedimiento no requiere la formación ni el recuento de colonias, se denomina «recuento virtual de colonias». Hasta el momento, la técnica VCC se ha limitado a péptidos antimicrobianos. Podría funcionar con otros agentes antimicrobianos, siempre que el caldo Mueller Hinton, doblemente concentrado, inactive su actividad antimicrobiana. El método VCC puede detectar actividad bactericida o bacteriostática, pero no distingue entre ambas. Sin embargo, la actividad bacteriostática puede cuantificarse midiendo la diferencia en los tiempos umbral entre los controles de «entrada» y «salida» (véase más adelante).

Se inocula un cultivo bacteriano de 2 mL a partir de una sola colonia y se cultiva durante la noche en medio de cultivo Mueller Hinton fosfato (PMH) o caldo de soja tripticasa Mueller Hinton fosfato (PMHT). El PMH es una mezcla 1:1 de caldo Mueller Hinton y fosfato de sodio 10 mM a pH 7,4. Se puede utilizar MHB con o sin ajuste de cationes. En algunos experimentos, se incluyó un 1 % de caldo de soja tripticasa (TSB) en el tampón de fosfato para mejorar la actividad de la defensina durante la incubación de dos horas; en este caso, la mezcla análoga 1:1 de tampón y caldo contenía un 0,5 % de TSB y se denomina PMHT. Se transfieren 250 μl de este cultivo a 25 mL de PMH en un matraz de filtro desechable de 125 mL. Este cultivo se cultiva a 37  °C con agitación a 250 rpm durante 2-3 horas hasta que la densidad óptica del cultivo a 650  nm esté entre 0,45 y 0,55. Mientras tanto, los péptidos antimicrobianos se diluyen en una placa de 96 pocillos (Costar 3595, que se tratan para cultivo de tejidos) en fosfato de sodio 10 mM pH 7,4 de manera que el volumen final sea de 90 microlitros. Las unidades formadoras de colonias virtuales, o UFCv, se definen en la publicación original de VCC ^{[ 1 ]} y su definición se repite aquí: las UFCv se mantuvieron constantes entre las seis cepas probadas de modo que la turbidez, y por lo tanto la cantidad de membrana celular, en cada experimento fuera aproximadamente igual. Debido a que las UFCv se estandarizaron a las UFC de Escherichia coli ATCC 25922, se pueden informar las UFC, no las UFCv, con esta cepa. Para la parte experimental del ensayo, las células se diluyen en fosfato de sodio 10 mM pH 7,4 de manera que la concentración celular final en 10 microlitros sea de 5 millones de UFCv/mL. Se pipetean 10 μl de esta suspensión celular debajo de los 90 μl de péptidos antimicrobianos en solución, lo que resulta en una suspensión celular con el inóculo estándar de 5 × 10⁵ ^UFCv /mL durante la exposición de las células a los péptidos antimicrobianos. Varios pocillos de la placa de 96 pocillos se utilizan como controles sin agente antimicrobiano; estos se denominan controles de "salida". La placa de 96 pocillos se incubó durante dos horas en el lector de placas, configurado para agitar y tomar lecturas cada cinco minutos. Durante este tiempo de incubación, el cultivo inicial se mantuvo en hielo. Para una curva de calibración , se agregó 1 mL de cultivo inicial a 1,5 mL de PMH después de la incubación de dos horas para generar una suspensión de 10 ⁸ UFCv/mL. Se realizó una serie de diluciones de 10 veces de esta suspensión, que abarcaba desde 10 ⁷ hasta 10 ⁰ UFCv/ml en un volumen total de 200 μl de PMH, ocupando ocho pocillos de la placa de 96 pocillos. En este momento, se agregaron células no expuestas a ningún agente antimicrobiano a varios pocillos de la placa a partir del cultivo mantenido en hielo; estos se denominan controles de "entrada", ya que indican el número de células presentes al inicio de la incubación de dos horas. En los experimentos VCC publicados inicialmente ^{[ 1 ]}Solo se utilizaron los 60 pocillos internos de la placa, ya que la evaporación cambió el volumen de los pocillos del borde durante la incubación de 12 horas. Sin embargo, los 96 pocillos de la placa de 96 pocillos pueden usarse para el experimento siempre que el borde de la placa esté cubierto con un trozo de Parafilm M de seis cuadrados de largo por medio cuadrado de ancho. El Parafilm permeable a los gases retarda la evaporación a la vez que permite la respiración celular y evita que las partículas sean arrastradas hacia la placa de 96 pocillos en el lector de placas. Una vez cubierta la placa con Parafilm, se transfiere de la cabina de bioseguridad al lector de placas. Varios modelos de lectores de placas con control de temperatura se han utilizado con éxito en ensayos VCC, incluyendo un Molecular Devices Vmax mantenido en una sala cálida, un Molecular Devices Spectramax y un Tecan Infinite M1000. El lector de placas está configurado para leer la densidad óptica a 650  nm cada 5 minutos durante 12 horas, agitando antes de cada lectura. Los datos brutos se importan a Microsoft Excel, donde se ejecuta la macro VCC Calculate para determinar el tiempo necesario para que cada curva de crecimiento alcance una densidad óptica umbral de 0,02.

El método de enumeración ^{[ 9 ]} de células supervivientes utilizado por VCC se denomina cinética de crecimiento cuantitativa (QGK). Relaciona el tiempo cinético que tarda la turbidez de un cultivo microbiológico bacteriano en un pocillo de una microplaca de 96 pocillos en alcanzar una diferencia umbral de turbidez con una serie de diluciones de 10 veces de curvas de crecimiento de calibración.

La cuantificación del número de células viables se realiza mediante un proceso matemáticamente idéntico a la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR), excepto que con QGK las células , en lugar de copias de productos de PCR, crecen exponencialmente. El tiempo que se tarda en alcanzar el umbral se llama "tiempo umbral", T _t , que es equivalente al valor de qPCR "tiempo de ciclo" o C _t .

Existen al menos cinco procesos que provocan retrasos en los tiempos umbral en los ensayos VCC:

1. La adhesión provoca que las células se adhieran a la microplaca y posiblemente formen biopelículas . A menos que estas células se encuentren directamente en el camino de la luz, su crecimiento no afectará las lecturas de densidad óptica.
2. La cohesión provoca que las células se agrupen en cúmulos de distintos tamaños en lugar de formar una suspensión homogénea de células individuales que se dividen por fisión binaria . La cohesión puede causar imprecisión y fluctuaciones en T _t . Los cúmulos cohesivos también pueden ser adhesivos, lo que genera tanto imprecisión debido a la cohesión como inexactitud (aumento de T _t ) debido a la adhesión.
3. Actividad bacteriostática , que hace que las células sean incapaces de entrar en crecimiento exponencial aunque no mueran. La actividad bacteriostática transitoria puede causar tiempos de latencia, aumentando T _t .
4. La fase de latencia metabólica del crecimiento bacteriano . Se esperaría que esta fase de latencia ocurriera en el ensayo, ya que las células que crecen lentamente o no crecen en absoluto durante la exposición inicial a los péptidos antimicrobianos en el tampón de baja concentración salina pasan a un crecimiento exponencial al añadir un medio rico con el doble de concentración. Si esta fase de latencia metabólica aumenta en presencia del péptido antimicrobiano, podría considerarse una forma de actividad bacteriostática transitoria de la categoría 3, aunque también son posibles otras fuentes de actividad bacteriostática transitoria, como un retraso debido al tiempo necesario para la reparación de estructuras celulares dañadas, como las paredes o las membranas celulares .
5. Actividad bactericida o eliminación. Un menor número de células supervivientes provoca un retraso en T _t , ya que las supervivientes tardan más en producir la misma cantidad de turbidez mediante crecimiento exponencial. Si todos los demás procesos que provocan aumentos en T _t son insignificantes, el ensayo VCC se convierte en un ensayo bactericida y T _t puede utilizarse para cuantificar las bacterias viables mediante QGK. En este caso simplificado, los resultados de "supervivencia virtual" del VCC son equivalentes a los resultados de "supervivencia" de un ensayo bactericida tradicional de recuento de colonias.

La VCC se empleó inicialmente para cuantificar la actividad antibacteriana de péptidos contra seis cepas de Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Bacillus cereus y Enterobacter aerogenes . ^{[ 1 ]} Comúnmente, se comparan una cepa de control de calidad estándar Gram-negativa y Gram-positiva . Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 29213 se han utilizado como cepas estándar Gram-negativa y Gram-positiva, respectivamente. La VCC también se ha aplicado a Bacillus anthracis , el agente causal del ántrax . ^{[ 10 ]} Además, la VCC se ha aplicado a Salmonella enterica serovar Typhimurium ^{[ 11 ]} y Acinetobacter baumannii . ^{[ 12 ]}

El estudio inicial de recuento virtual de colonias midió la actividad de las seis alfa defensinas humanas simultáneamente en la misma placa de 96 pocillos: HNP1 , HNP2 , HNP3 , HNP4 , HD5 y HD6 . ^{[ 1 ]} Posteriormente, se estudiaron formas mutadas de algunas de esas seis defensinas mediante VCC. Una glicina conservada en una protuberancia beta en HNP2 fue reemplazada con una serie de D-aminoácidos que dieron como resultado una actividad VCC proporcional a la hidrofobicidad de la cadena lateral y la carga. ^{[ 13 ]} VCC mostró que la actividad de HNP2 acetilada en el extremo N y/o amidada en el extremo C es proporcional a la carga electrostática . ^{[ 14 ]} Los resultados de VCC fueron nuevamente proporcionales a la carga para una serie de mutantes que interrumpieron el puente salino, lo que sugiere que el puente salino no es necesario para la función de HNP2. ^{[ 15 ]} VCC midió la importancia de los segmentos pro naturales y artificiales N-terminales del propéptido HNP1, alterando drásticamente la actividad contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus . ^{[ 16 ] [ 17 ]} Las formas enantioméricas de HNP1, HNP4, HD5 y Beta-defensina 2 compuestas enteramente de D-aminoácidos sugirieron diferentes mecanismos de actividad defensina contra bacterias Gram positivas y Gram negativas . ^{[ 18 ]} Los resultados de VCC de las formas de monómero con dimerización alterada y dímero unido de HNP1 demostraron la importancia de la dimerización . ^{[ 19 ]} Reemplazar la glicina conservada con L- alanina resultó en sutiles diferencias de VCC. ^{[ 20 ]} La mutagénesis de escaneo de alanina integral de HNP1 ^{[ 21 ] [ 22 ]} y HD5 ^{[ 23 ]} demostró la importancia de los residuos hidrofóbicos voluminosos. La reducción de disulfuro de HD5 afectó la actividad de VCC pero mejoró la actividad de unión de lipopolisacáridos contra tres cepas Gram negativas. ^{[ 11 ]} Las variantes de HD5 con un enlace disulfuro o sin enlaces disulfuro exhibieron una actividad de VCC muy reducida contraA. baumannii , mientras que un derivado simplificado de HD5 construido por reducción de disulfuro e introducción de arginina mostró una potente actividad contra una cepa multirresistente de A. baumannii . ^{[ 12 ]} Estos estudios se han ampliado para incluir defensinas beta adicionales , defensinas theta , ^{[ 10 ]} y la catelicidina humana LL-37 y péptidos relacionados. ^{[ 2 ]} Los resultados del recuento virtual de colonias de un estudio de las criptdinas de ratón mostraron que la eliminación de E. coli por las criptdinas es generalmente independiente de sus estructuras terciaria y cuaternaria que son importantes para la eliminación de S. aureus , lo que indica dos mecanismos de acción distintos. ^{[ 24 ]}

Se ha descrito previamente un efecto de inóculo para muchos agentes antimicrobianos, de modo que el agente es menos eficaz cuando se añaden más bacterias al ensayo. ^{[ 25 ]} Este efecto se observa a menudo con betalactámicos cuando se ensayan contra bacterias productoras de betalactamasa. El efecto de inóculo fue potencialmente relevante para un estudio de HNP1, pro LL-37 y LL-37 que incluyó tanto el recuento de colonias tradicional como el VCC en paralelo. ^{[ 2 ]} En ese informe, se encontró que los valores de supervivencia del recuento de colonias tradicional eran menores que los valores de supervivencia virtual para todos los péptidos y cepas probados. Dado que el inóculo de bacterias fue 20 veces mayor en el ensayo VCC en comparación con el protocolo estandarizado de recuento de colonias tradicional utilizado, la diferencia podría haberse debido a un efecto de inóculo, aunque el efecto habría sido el inverso del efecto de inóculo que normalmente se observa con otros agentes antimicrobianos, ya que el inóculo más alto mostró más actividad. Esta posibilidad se investigó en una serie de experimentos VCC centrados principalmente en la defensina HNP1 y las cepas bacterianas E. coli, S. aureus y B. cereus . Los resultados de seis experimentos demostraron un marcado efecto de inóculo de HNP1 contra E. coli . ^{[ 26 ]}

Se han publicado hojas de cálculo complejas de Microsoft Excel utilizadas para el cálculo de valores de supervivencia virtual y dosis letal virtual, así como una macro de Visual Basic utilizada para calcular tiempos umbral. ^{[ 26 ]} Las hojas de cálculo y la macro también se han depositado en GitHub. ^{[ 27 ]}

Se advierte a los usuarios de VCC que transfieran las células en un volumen pequeño, como 10 microlitros, debajo de un volumen mayor, como 90 microlitros, de forma similar a las curvas de calibración QGK mostradas arriba y las curvas de calibración reportadas en la publicación inicial de VCC, ^{[ 1 ]} pero a diferencia del procedimiento experimental utilizado para probar la actividad de la defensina en ese mismo artículo. La técnica de pipeteo mejorada se describió en 2011 en el estudio del patógeno de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) Bacillus anthracis . ^{[ 10 ]} El método original publicado en 2005 implicaba la transferencia de 50 microlitros de suspensiones celulares a 50 microlitros de líquido, lo que genera espuma, burbujas y turbidez que es incompatible con un método turbidimétrico cuando las células se transfieren directamente al fondo de los pocillos debajo de las soluciones tampón de fosfato. Evitar este problema agregando suspensiones celulares como gotas desde arriba puede causar aerosoles que resultan en contaminación cruzada. ^{[ 28 ]} Los bioaerosoles de bacterias peligrosas también pueden plantear riesgos para la seguridad que pueden reducirse realizando experimentos dentro de una cabina de bioseguridad .

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• Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y Biomédicos (BMBL) 6.ª edición