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Secuenciación de ADN mediante microscopía electrónica de transmisión

El microscopio electrónico puede alcanzar una resolución de hasta 100 picómetros , lo que permite visualizar células eucariotas, células procariotas, virus, ribosomas e incluso ...

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El microscopio electrónico puede alcanzar una resolución de hasta 100 picómetros , lo que permite visualizar células eucariotas, células procariotas, virus, ribosomas e incluso átomos individuales (nótese la escala logarítmica ).

La secuenciación de ADN mediante microscopía electrónica de transmisión es una tecnología de secuenciación de molécula única que utiliza técnicas de microscopía electrónica de transmisión . El método fue concebido y desarrollado en las décadas de 1960 y 1970, [ 1 ] pero cayó en desuso cuando se reconoció el alcance del daño a la muestra. [ 2 ]

Para visualizar claramente el ADN bajo un microscopio electrónico , es necesario marcarlo con átomos pesados. Además, las técnicas de imagen especializadas y la óptica con corrección de aberraciones son beneficiosas para obtener la resolución requerida para visualizar la molécula de ADN marcada. En teoría, la secuenciación de ADN mediante microscopía electrónica de transmisión podría proporcionar lecturas extremadamente largas, pero el problema del daño causado por el haz de electrones aún persiste y la tecnología todavía no se ha desarrollado comercialmente.

Historia

Apenas unos años después de que James Watson y Francis Crick dedujeran la estructura del ADN , y casi dos décadas antes de que Frederick Sanger publicara el primer método para la secuenciación rápida del ADN , Richard Feynman , un físico estadounidense, vislumbró el microscopio electrónico como la herramienta que algún día permitiría a los biólogos "ver el orden de las bases en la cadena de ADN ". [ 3 ] Feynman creía que si el microscopio electrónico se hacía lo suficientemente potente, entonces sería posible visualizar la estructura atómica de cualquier compuesto químico, incluido el ADN.

En 1970, Albert Crewe desarrolló la técnica de imagen de campo oscuro anular de alto ángulo (HAADF) en un microscopio electrónico de transmisión de barrido . Mediante esta técnica, visualizó átomos pesados ​​individuales en películas delgadas de carbono amorfo. [ 4 ] En 2010, Krivanek y sus colegas informaron varias mejoras técnicas al método HAADF, incluyendo una combinación de óptica electrónica con corrección de aberraciones y bajo voltaje de aceleración. Este último es crucial para la obtención de imágenes de objetos biológicos, ya que permite reducir el daño causado por el haz y aumentar el contraste de la imagen para átomos ligeros. Como resultado, se pudieron obtener imágenes de sustituciones de átomos individuales en una monocapa de nitruro de boro. [ 5 ]

A pesar de la invención de multitud de tecnologías de secuenciación química y fluorescente, la microscopía electrónica sigue siendo objeto de exploración como método para la secuenciación de ADN de molécula única. Por ejemplo, en 2012, una colaboración entre científicos de la Universidad de Harvard , la Universidad de New Hampshire y ZS Genetics demostró la capacidad de leer largas secuencias de ADN utilizando esta técnica, [ 6 ] sin embargo, la tecnología de secuenciación de ADN mediante microscopía electrónica de transmisión aún está lejos de estar disponible comercialmente. [ 7 ]

Principio

El microscopio electrónico tiene la capacidad de obtener una resolución de hasta 100 pm, lo que permite observar biomoléculas y estructuras microscópicas como virus, ribosomas, proteínas, lípidos, moléculas pequeñas e incluso átomos individuales. [ 8 ]

Aunque el ADN es visible al observarlo con el microscopio electrónico, la resolución de la imagen obtenida no es lo suficientemente alta como para descifrar la secuencia de las bases individuales , es decir , la secuenciación del ADN . Sin embargo, mediante el marcaje diferencial de las bases del ADN con átomos pesados ​​o metales, es posible visualizar y distinguir entre las bases individuales. Por lo tanto, la microscopía electrónica, junto con el marcaje diferencial del ADN con átomos pesados, podría utilizarse para obtener imágenes directas del ADN y determinar su secuencia. [ 7 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]

Flujo de trabajo

Flujo de trabajo de la secuenciación de ADN mediante microscopía electrónica de transmisión

Paso 1 – Desnaturalización del ADN

Al igual que en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) estándar , las moléculas de ADN de doble cadena que se van a secuenciar deben desnaturalizarse antes de que se pueda sintetizar la segunda cadena con nucleótidos marcados.

Paso 2 – Marcaje de átomos pesados

Los elementos que componen las moléculas biológicas ( C , H , N , O , P , S ) son demasiado ligeros ( número atómico, Z ) para ser visualizados claramente como átomos individuales mediante microscopía electrónica de transmisión . Para solucionar este problema, las bases del ADN pueden marcarse con átomos más pesados ​​(Z más alto). Cada nucleótido se etiqueta con un marcador pesado característico, lo que permite distinguirlos en la micrografía electrónica de transmisión.

  • ZS Genetics propone utilizar tres marcadores pesados: bromo (Z=35), yodo (Z=53) y triclorometano (Z total=63). Estos aparecerían como puntos oscuros y claros diferenciales en la micrografía, y la cuarta base del ADN permanecería sin marcar.
  • Halcyon Molecular, en colaboración con el grupo Toste, propone que las bases de purina y pirimidina pueden funcionalizarse con diamina de platino o tetraóxido de osmio bipiridina, respectivamente. Átomos de metales pesados ​​como el osmio (Z=76), el iridio (Z=77), el oro (Z=79) o el uranio (Z=92) pueden entonces formar enlaces metal-metal con estos grupos funcionales para marcar las bases individuales. [ 12 ]

Paso 3 – Alineación del ADN en el sustrato

Las moléculas de ADN deben extenderse sobre un sustrato sólido y delgado para que el orden de las bases marcadas sea claramente visible en la micrografía electrónica. El peinado molecular es una técnica que utiliza la fuerza de una interfaz aire-agua en retroceso para extender las moléculas de ADN, dejándolas unidas irreversiblemente a una capa de silano una vez secas. [ 13 ] [ 14 ] Este es uno de los métodos para lograr la alineación del ADN sobre un sustrato sólido.

Paso 4 – Imágenes TEM

Imagen de microscopía electrónica de ADN: unidades de transcripción ribosómica de Chironomus pallidivitatus . Esta imagen se obtuvo con tecnología relativamente antigua (alrededor de 2005).

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) produce imágenes de alta magnificación y alta resolución al hacer pasar un haz de electrones a través de una muestra muy delgada. Si bien se ha demostrado la resolución atómica con la TEM convencional, una mayor mejora en la resolución espacial requiere corregir las aberraciones esféricas y cromáticas de las lentes del microscopio . Esto solo ha sido posible en la microscopía electrónica de transmisión de barrido, donde la imagen se obtiene al escanear el objeto con un haz de electrones finamente enfocado, de manera similar a un tubo de rayos catódicos . Sin embargo, la mejora en la resolución lograda viene acompañada de la irradiación del objeto estudiado con intensidades de haz mucho mayores, el consiguiente daño a la muestra y los artefactos de imagen asociados. [ 15 ] Se aplican diferentes técnicas de imagen dependiendo de si la muestra contiene átomos pesados ​​o ligeros:

  • La microscopía de campo oscuro anular mide la dispersión de electrones al desviarse de los núcleos de los átomos en la muestra de microscopía electrónica de transmisión. [ 5 ] Esta técnica es más adecuada para muestras que contienen átomos pesados, ya que estos causan una mayor dispersión de electrones. Se ha utilizado para obtener imágenes de átomos tan ligeros como el boro , el nitrógeno y el carbono ; [ 5 ] sin embargo, la señal es muy débil para estos átomos ligeros. Si se utiliza la microscopía de campo oscuro anular para la secuenciación de ADN mediante microscopía electrónica de transmisión, sin duda será necesario marcar las bases del ADN con átomos pesados ​​para poder detectar una señal fuerte.
  • La microscopía electrónica de campo claro anular detecta electrones transmitidos directamente a través de la muestra y mide la interferencia de onda producida por sus interacciones con los núcleos atómicos. Esta técnica puede detectar átomos ligeros con mayor sensibilidad que los métodos de microscopía electrónica de campo oscuro anular. De hecho, se han obtenido imágenes de oxígeno , [ 16 ] nitrógeno , [ 16 ] litio [ 17 ] e hidrógeno [ 18 ] en sólidos cristalinos mediante microscopía electrónica de campo claro anular. Por lo tanto, teóricamente es posible obtener imágenes directas de los átomos en la cadena de ADN; sin embargo, la estructura del ADN es mucho menos geométrica que la de los sólidos cristalinos, por lo que la obtención de imágenes directas sin marcaje previo podría no ser factible.

Paso 5 – Análisis de datos

Los puntos oscuros y brillantes en la micrografía electrónica, que corresponden a las bases de ADN marcadas diferencialmente, se analizan mediante un programa informático.

Aplicaciones

La secuenciación de ADN mediante microscopía electrónica de transmisión aún no está disponible comercialmente, pero la gran longitud de lectura que esta tecnología podría proporcionar algún día la hará útil en diversos contextos.

Ensamblaje de genoma de novo

Al secuenciar un genoma, este debe dividirse en fragmentos lo suficientemente cortos como para ser secuenciados en una sola lectura. Estas lecturas deben luego reconstruirse como un rompecabezas, alineando las regiones que se superponen entre ellas; este proceso se denomina ensamblaje de novo del genoma . Cuanto mayor sea la longitud de lectura que proporciona una plataforma de secuenciación, mayores serán las regiones superpuestas y más fácil será ensamblar el genoma. Desde una perspectiva computacional, la secuenciación Sanger microfluídica sigue siendo la forma más eficaz de secuenciar y ensamblar genomas para los que no existe una secuencia de referencia . Las longitudes de lectura relativamente largas proporcionan una superposición sustancial entre las lecturas de secuenciación individuales, lo que permite una mayor confianza estadística en el ensamblaje. Además, las lecturas largas de Sanger pueden abarcar la mayoría de las regiones de secuencias de ADN repetitivas que, de otro modo, dificultan el ensamblaje de secuencias al causar alineaciones falsas. Sin embargo, el ensamblaje de novo del genoma mediante secuenciación Sanger es extremadamente costoso y requiere mucho tiempo. Las tecnologías de secuenciación de segunda generación , [ 19 ] si bien son menos costosas, generalmente no son adecuadas para el ensamblaje de novo del genoma debido a la corta longitud de las lecturas. En general, las tecnologías de secuenciación de tercera generación [ 11 ] , incluida la secuenciación de ADN mediante microscopía electrónica de transmisión, buscan mejorar la longitud de lectura manteniendo un bajo costo de secuenciación. Por lo tanto, a medida que mejoren las tecnologías de secuenciación de tercera generación, el ensamblaje de genomas de novo rápido y económico se convertirá en una realidad.

Haplotipos completos

Un haplotipo es una serie de alelos ligados que se heredan juntos en un solo cromosoma. La secuenciación de ADN se puede utilizar para genotipificar todos los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que constituyen un haplotipo. Sin embargo, las lecturas cortas de secuenciación de ADN a menudo no se pueden fasear; es decir, las variantes heterocigotas no se pueden asignar con certeza al haplotipo correcto. De hecho, la haplotipificación con datos de secuenciación de ADN de lectura corta requiere una cobertura muy alta (cobertura promedio >50x de cada base de ADN) para identificar con precisión los SNP, así como datos de secuencia adicionales de los padres para que se pueda utilizar la transmisión mendeliana para estimar los haplotipos. [ 20 ] Las tecnologías de secuenciación que generan lecturas largas, incluida la secuenciación de ADN por microscopía electrónica de transmisión, pueden capturar bloques de haplotipos completos en una sola lectura. Es decir, los haplotipos no se dividen entre múltiples lecturas, y los alelos genéticamente ligados permanecen juntos en los datos de secuenciación. Por lo tanto, las lecturas largas hacen que la determinación de haplotipos sea más fácil y precisa, lo cual resulta beneficioso para el campo de la genética de poblaciones .

Variantes del número de copias

Los genes normalmente están presentes en dos copias en el genoma humano diploide ; los genes que se desvían de este número de copias estándar se denominan variantes del número de copias (CNV) . La variación del número de copias puede ser benigna (estas suelen ser variantes comunes, llamadas polimorfismos del número de copias) o patogénica. [ 21 ] Las CNV se detectan mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH) o hibridación genómica comparativa (CGH) . Para detectar los puntos de ruptura específicos en los que ocurre una deleción, o para detectar lesiones genómicas introducidas por un evento de duplicación o amplificación, se puede realizar CGH utilizando un array de mosaico ( array CGH ), o se puede secuenciar la región variante. Las lecturas de secuenciación largas son especialmente útiles para analizar duplicaciones o amplificaciones, ya que es posible analizar la orientación de los segmentos amplificados si se capturan en una sola lectura de secuenciación.

Cáncer

La genómica del cáncer, u oncogenómica , es un campo emergente en el que se está aplicando la tecnología de secuenciación de ADN de segunda generación de alto rendimiento para secuenciar genomas cancerosos completos. El análisis de estos datos de secuenciación de lectura corta abarca todos los problemas asociados con el ensamblaje de novo del genoma utilizando datos de lectura corta. [ 22 ] Además, los genomas cancerosos suelen ser aneuploides . [ 23 ] Estas aberraciones, que son esencialmente variantes de número de copias a gran escala, pueden analizarse mediante tecnologías de secuenciación de segunda generación utilizando la frecuencia de lectura para estimar el número de copias. [ 22 ] Sin embargo, las lecturas más largas proporcionarían una imagen más precisa del número de copias, la orientación de las regiones amplificadas y los SNP presentes en los genomas cancerosos.

secuenciación del microbioma

El microbioma se refiere al conjunto total de microbios presentes en un microambiente y sus respectivos genomas. Por ejemplo, se estima que 100 billones de células microbianas colonizan el cuerpo humano en cualquier momento dado. [ 24 ] El microbioma humano es de particular interés, ya que estas bacterias comensales son importantes para la salud y la inmunidad humanas. La mayoría de los genomas bacterianos de la Tierra aún no se han secuenciado; emprender un proyecto de secuenciación del microbioma requeriría un extenso ensamblaje de novo del genoma, una perspectiva que resulta desalentadora con las tecnologías de secuenciación de ADN de lectura corta. [ 25 ] Las lecturas más largas facilitarían enormemente el ensamblaje de nuevos genomas microbianos.

Fortalezas y debilidades

En comparación con otras tecnologías de secuenciación de ADN de segunda y tercera generación, la secuenciación de ADN mediante microscopía electrónica de transmisión presenta una serie de posibles ventajas y desventajas clave, que en última instancia determinarán su utilidad y relevancia como tecnología futura de secuenciación de ADN.

Fortalezas

  • Longitudes de lectura más largas : ZS Genetics ha estimado que las longitudes de lectura potenciales de la secuenciación de ADN mediante microscopía electrónica de transmisión oscilan entre 10 000 y 20 000 pares de bases, con una tasa de 1700 millones de pares de bases por día. [ 7 ] Estas longitudes de lectura largas permitirían un ensamblaje de genoma de novo más sencillo y la detección directa de haplotipos, entre otras aplicaciones. [ 11 ]
  • Menor coste : Se estima que la secuenciación de ADN mediante microscopía electrónica de transmisión cuesta tan solo entre 5.000 y 10.000 dólares estadounidenses por genoma humano, en comparación con las alternativas de secuenciación de ADN de segunda generación, que son más caras. [ 10 ]
  • Sin desfase : El desfase de las hebras de ADN debido a la pérdida de sincronicidad durante la síntesis es un problema importante de las tecnologías de secuenciación de segunda generación. Para la secuenciación de ADN por microscopía electrónica de transmisión y otras tecnologías de secuenciación de tercera generación, la sincronización de las lecturas es innecesaria, ya que solo se lee una molécula a la vez. [ 7 ] [ 11 ]
  • Menor tiempo de respuesta : La capacidad de leer fragmentos nativos de ADN hace que la preparación compleja de plantillas sea un paso innecesario en el flujo de trabajo general de la secuenciación del genoma completo. En consecuencia, es posible reducir los tiempos de respuesta. [ 11 ]

Debilidades

  • Alto costo de capital : Un microscopio electrónico de transmisión con la resolución suficiente para la secuenciación de ADN mediante microscopía electrónica de transmisión cuesta aproximadamente US$1.000.000; por lo tanto, realizar la secuenciación de ADN mediante este método requiere una inversión sustancial. [ 10 ]
  • Técnicamente complejo : El marcaje selectivo con átomos pesados ​​y la fijación y el enderezamiento del ADN marcado a un sustrato representan un serio desafío técnico. [ 10 ] Además, la muestra de ADN debe ser estable al alto vacío del microscopio electrónico y a la irradiación con un haz enfocado de electrones de alta energía.
  • Posibles sesgos y artefactos de la PCR : Aunque la PCR solo se utiliza en la secuenciación de ADN por microscopía electrónica de transmisión como medio para marcar la cadena de ADN con átomos pesados ​​o metales, podría existir la posibilidad de introducir sesgos en la representación de la plantilla o errores durante la amplificación única. [ 10 ]

Comparación con otras tecnologías de secuenciación

Se han desarrollado o se están desarrollando actualmente numerosas tecnologías de secuenciación de ADN de segunda y tercera generación, distintas del método de Sanger, con el objetivo común de aumentar el rendimiento y reducir los costes, de modo que la medicina genética personalizada pueda hacerse realidad por completo.

Tanto el premio Archon X Prize for Genomics de 10 millones de dólares estadounidenses, financiado por la Fundación X Prize (Santa Mónica, California, EE. UU.), como las subvenciones por valor de 70 millones de dólares estadounidenses financiadas por el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH-NHGRI) están impulsando el rápido auge de la actividad investigadora en el desarrollo de nuevas tecnologías de secuenciación de ADN. [ 7 ]

Dado que cada tecnología de secuenciación de ADN se define por diferentes enfoques, técnicas y estrategias, cada una tiene sus propias ventajas y desventajas. En la Tabla 1 se presenta una comparación de parámetros importantes entre diversas tecnologías de secuenciación de ADN de segunda y tercera generación.

Referencias

  1. ↑ [ Michael Beer y Richard Zobel (1961) "Electron stains II: Electron microscopic studies on the visibility of stained DNA molecules" J. Mol. Biol. Volumen 3, Número 6, diciembre de 1961, Páginas 717–726, IN3–IN5"]
  2. ↑ [M. Cole et al (1977) "Microscopía molecular de polinucleótidos marcados: Estabilidad de los átomos de osmio" J. Mol. Biol. Volumen 117, Número 2, 5 de diciembre de 1977, Páginas 387–400]
  3. ↑ Feynman R. (1959) Hay mucho espacio en el fondo . Conferencia de Caltech.
  4. ↑ Crewe, Albert V; Wall, J.; Langmore, J. (1970). "Visibilidad de un solo átomo". Science . 168 (3937): 1338– 1340. Bibcode : 1970Sci...168.1338C . doi : 10.1126/science.168.3937.1338 . PMID 17731040 . S2CID 31952480 .  
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