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Los conjuntos de mosaicos son un subtipo de chips de microarrays . Al igual que los microarrays tradicionales, funcionan mediante la hibridación de moléculas objetivo de ADN o ARN marcadas con sondas fijadas a una superficie sólida.
Los arreglos de mosaico se diferencian de los microarrays tradicionales en la naturaleza de las sondas. En lugar de sondear secuencias de genes conocidos o predichos que pueden estar dispersos por todo el genoma , los arreglos de mosaico sondean intensivamente secuencias que se sabe que existen en una región contigua. Esto es útil para caracterizar regiones que están secuenciadas, pero cuyas funciones locales son en gran medida desconocidas. Los arreglos de mosaico ayudan en el mapeo del transcriptoma , así como en el descubrimiento de sitios de interacción ADN/ proteína ( ChIP-chip , DamID ), de metilación del ADN (MeDIP-chip) y de sensibilidad a la DNasa (DNase Chip) y array CGH. [ 1 ] Además de detectar genes y secuencias reguladoras previamente no identificados, es posible una cuantificación mejorada de los productos de transcripción. Las sondas específicas están presentes en millones de copias (a diferencia de solo unas pocas en los arreglos tradicionales) dentro de una unidad de arreglo llamada característica, con entre 10 000 y más de 6 000 000 de características diferentes por arreglo. [ 2 ] Se pueden obtener resoluciones de mapeo variables ajustando la cantidad de superposición de secuencias entre sondas, o la cantidad de pares de bases conocidos entre secuencias de sondas, así como la longitud de la sonda. Para genomas más pequeños como Arabidopsis , se pueden examinar genomas completos. [ 3 ] Los arreglos de mosaico son una herramienta útil en estudios de asociación de todo el genoma .
Síntesis y fabricantes
Las dos principales formas de sintetizar matrices de teselado son la fabricación fotolitográfica y la impresión o deposición mecánica.
El primer método consiste en la síntesis in situ , donde se construyen sondas de aproximadamente 25 pares de bases sobre la superficie del chip. Estas matrices pueden albergar hasta 6 millones de elementos discretos, cada uno de los cuales contiene millones de copias de una misma sonda.
Otra forma de sintetizar chips de matriz de teselado es mediante la impresión mecánica de sondas sobre el chip. Esto se realiza utilizando máquinas automatizadas con pines que colocan las sondas previamente sintetizadas sobre la superficie. Debido a la limitación de tamaño de los pines, estos chips pueden contener hasta casi 400 000 características. [ 4 ] Tres fabricantes de matrices de teselado son Affymetrix , NimbleGen y Agilent . Sus productos varían en longitud y espaciado de las sondas. ArrayExplorer.com es un servidor web gratuito para comparar matrices de teselado.
Aplicaciones y tipos
Chip de chip
ChIP-chip es una de las aplicaciones más populares de los microarrays de cromatina. La inmunoprecipitación de cromatina permite identificar los sitios de unión de las proteínas . Una variante a escala genómica se conoce como ChIP-on-chip. Las proteínas que se unen a la cromatina se entrecruzan in vivo , generalmente mediante fijación con formaldehído . A continuación, la cromatina se fragmenta y se expone a anticuerpos específicos para la proteína de interés. Estos complejos se precipitan. El ADN se aísla y purifica. En los microarrays de ADN tradicionales, el ADN inmunoprecipitado se hibrida con el chip, que contiene sondas diseñadas para cubrir regiones representativas del genoma. Se pueden utilizar sondas superpuestas o muy próximas entre sí. Esto proporciona un análisis imparcial con alta resolución. Además de estas ventajas, los microarrays de cromatina muestran una alta reproducibilidad y, gracias a las sondas superpuestas que abarcan grandes segmentos del genoma, permiten analizar los sitios de unión de proteínas que contienen secuencias repetitivas. Los experimentos de ChIP-chip han permitido identificar sitios de unión de factores de transcripción en todo el genoma en levaduras, drosophila y algunas especies de mamíferos. [ 5 ]
Mapeo del transcriptoma
Otro uso popular de los arreglos de mosaico es en la búsqueda de genes expresados. Los métodos tradicionales de predicción de genes para la anotación de secuencias genómicas han tenido problemas cuando se utilizan para mapear el transcriptoma, como no producir una estructura precisa de los genes y también omitir transcripciones por completo. El método de secuenciación de ADNc para encontrar genes transcritos también presenta problemas, como no detectar moléculas de ARN raras o muy cortas, y por lo tanto no detecta genes que están activos solo en respuesta a señales o específicos de un marco de tiempo. Los arreglos de mosaico pueden resolver estos problemas. Debido a la alta resolución y sensibilidad, incluso las moléculas pequeñas y raras pueden detectarse. La naturaleza superpuesta de las sondas también permite la detección de ARN no poliadenilado y puede producir una imagen más precisa de la estructura del gen . [ 6 ] Estudios anteriores en los cromosomas 21 y 22 mostraron el poder de los arreglos de mosaico para identificar unidades de transcripción. [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] Los autores utilizaron sondas de 25 mer que estaban separadas por 35 pb, abarcando los cromosomas completos. Los objetivos marcados se hicieron a partir de ARN poliadenilado. Encontraron muchos más transcritos de los predichos y el 90% estaban fuera de los exones anotados. Otro estudio con Arabidopsis utilizó matrices de oligonucleótidos de alta densidad que cubren todo el genoma. Se encontraron más de 10 veces más transcritos de los predichos por EST y otras herramientas de predicción. [ 3 ] [ 10 ] También se encontraron nuevos transcritos en las regiones centroméricas donde se pensaba que no se expresaban genes activamente. Se han identificado muchos ARN antisentido naturales y no codificantes utilizando matrices de mosaico. [ 9 ]
Chip MeDIP
La inmunoprecipitación de ADN metilado, seguida de un análisis de microarrays, permite mapear y medir la metilación del ADN en todo el genoma. El ADN se metila en la citosina de los dinucleótidos CG en numerosos lugares del genoma. Esta modificación es uno de los cambios epigenéticos heredados mejor comprendidos y se ha demostrado que afecta la expresión génica. El mapeo de estos sitios puede ampliar el conocimiento sobre los genes expresados y la regulación epigenética a nivel genómico. Los estudios con microarrays han generado mapas de metilación de alta resolución para el genoma de Arabidopsis, creando así el primer "metiloma".
Chip de DNasa
El chip de DNasa es una aplicación de los microarrays de mosaico para identificar sitios hipersensibles, segmentos de cromatina abierta que son más fácilmente escindidos por la DNasa I. El escindido por la DNasa I produce fragmentos más grandes, de aproximadamente 1,2 kb. Se ha demostrado que estos sitios hipersensibles predicen con precisión elementos reguladores como regiones promotoras, potenciadores y silenciadores. [ 11 ] Históricamente, el método utiliza la transferencia Southern para encontrar fragmentos digeridos. Los microarrays de mosaico han permitido a los investigadores aplicar la técnica a escala genómica.
Hibridación genómica comparativa (CGH)
La CGH basada en microarrays es una técnica frecuentemente utilizada en diagnóstico para comparar diferencias entre tipos de ADN, como células normales frente a células cancerosas. Para la CGH en microarrays se suelen utilizar dos tipos de microarrays: de genoma completo y de microarrays de alta resolución. El enfoque de genoma completo resulta útil para identificar variaciones en el número de copias con alta resolución. Por otro lado, la CGH en microarrays de alta resolución permite detectar otras anomalías, como puntos de ruptura. [ 12 ]
Procedimiento
Existen varios métodos para la creación de microarrays. Un protocolo para analizar la expresión génica consiste en aislar primero el ARN total. Este se purifica para eliminar las moléculas de ARNr. El ARN se copia en ADN de doble cadena, que posteriormente se amplifica y se transcribe in vitro a ARNc. El producto se divide por triplicado para producir ADN de doble cadena, que luego se fragmenta y se marca. Finalmente, las muestras se hibridan al chip del microarray. Las señales del chip se escanean e interpretan mediante ordenadores.
Existen diversos programas y algoritmos para el análisis de datos, cuyas ventajas varían según el fabricante del chip. Para los chips Affymetrix, el análisis basado en modelos de matrices de mosaico (MAT) o el análisis hipergeométrico de matrices de mosaico (HAT [ 13 ] ) son algoritmos eficaces para la búsqueda de picos. Para los chips NimbleGen, TAMAL es más adecuado para localizar sitios de unión. Otros algoritmos alternativos incluyen MA2C y TileScope, que son más sencillos de usar. El algoritmo de deconvolución de unión conjunta se utiliza comúnmente para los chips Agilent. Si se requiere el análisis de secuencias de sitios de unión o la anotación del genoma, se utilizan programas como MEME, Gibbs Motif Sampler, el sistema de anotación de elementos reguladores cis y Galaxy . [ 4 ]
Ventajas y desventajas
Los microarrays de baldosas proporcionan una herramienta imparcial para investigar la unión de proteínas, la expresión génica y la estructura genética a escala genómica. Permiten un nuevo nivel de comprensión en el estudio del transcriptoma y el metiloma.
Entre las desventajas se incluye el costo de los kits de microarrays de mosaico. Si bien los precios han disminuido en los últimos años, su costo hace que el uso de microarrays de mosaico a nivel genómico resulte poco práctico para el genoma de mamíferos y otros genomas grandes. Otro problema es el "ruido transcripcional" producido por su capacidad de detección ultrasensible. [ 2 ] Además, este método no proporciona un inicio ni un final claramente definidos para las regiones de interés identificadas por el microarray. Finalmente, los microarrays generalmente solo proporcionan números de cromosoma y posición, lo que a menudo requiere la secuenciación como un paso separado (aunque algunos microarrays modernos sí proporcionan información de secuencia. [ 14 ] )
Referencias
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