Etiqueta estreptocócica

El sistema Strep-tag es un método que permite la purificación y detección de proteínas mediante cromatografía de afinidad . El Strep-tag II es un péptido sintético compuesto por ocho aminoácidos ( Trp - Ser - His - Pro - Gln - Phe - Glu - Lys ). Esta secuencia peptídica presenta afinidad intrínseca por Strep-Tactin, una estreptavidina diseñada específicamente , y puede fusionarse en el extremo N o C a proteínas recombinantes. Aprovechando esta interacción altamente específica, las proteínas marcadas con Strep -tag pueden aislarse en un solo paso a partir de lisados ​​celulares brutos. Debido a que el Strep -tag eluye en condiciones fisiológicas suaves, resulta especialmente adecuado para la generación de proteínas funcionales. ^{[ 1 ] [ 2 ]}

Strep-tag, Twin-Strep-tag y Strep-Tactin son marcas registradas de IBA Lifesciences GmbH .

La estreptavidina es una proteína tetramérica expresada en Streptomyces avidinii . Debido a su alta afinidad por la vitamina H ( biotina ), se utiliza comúnmente en biología molecular y biotecnología . La etiqueta Strep-tag se seleccionó originalmente de una biblioteca genética para unirse específicamente a una versión central de la estreptavidina, truncada proteolíticamente. Con el tiempo, la etiqueta Strep-tag se optimizó sistemáticamente para permitir una mayor flexibilidad en la elección del sitio de unión. Además, su proteína interactuante, la estreptavidina, también se optimizó para aumentar su capacidad de unión a péptidos, lo que dio lugar al desarrollo de Strep-Tactin. La afinidad de unión de Strep-tag a Strep-Tactin es casi 100 veces mayor que la de Strep-tag a estreptavidina. El denominado sistema Strep-tag, compuesto por Strep-tag y Strep-Tactin, ha demostrado ser particularmente útil para el aislamiento funcional y el análisis de complejos proteicos en la investigación del proteoma . ^{[ 3 ]}

Al igual que otras etiquetas de afinidad corta ( etiqueta His , etiqueta FLAG ), la etiqueta Strep se puede fusionar fácilmente a proteínas recombinantes durante la subclonación de su ADNc o gen . Para su expresión, se dispone de varios vectores para diversos organismos hospedadores ( E. coli , levadura , células de insectos y mamíferos ). ^{[ 4 ]} Una ventaja particular de la etiqueta Strep es su tamaño relativamente pequeño y el hecho de que es bioquímicamente casi inerte . Por lo tanto, no afecta al plegamiento ni a la secreción de proteínas y, por lo general, no interfiere con la función proteica. La etiqueta Strep es especialmente adecuada para el análisis de proteínas funcionales, ya que el procedimiento de purificación se puede mantener en condiciones fisiológicas. Esto no solo permite el aislamiento de proteínas sensibles en estado nativo, sino que también es posible purificar complejos proteicos intactos, ^{[ 5 ]} incluso si solo una subunidad porta la etiqueta.

En el primer paso del ciclo de purificación de Strep-tag, el lisado celular que contiene la proteína de fusión Strep-tag se aplica a una columna con Strep-Tactin inmovilizada (paso 1). Después de que la proteína marcada se haya unido específicamente a Strep-Tactin, un breve paso de lavado con un tampón fisiológico (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, PBS) elimina todas las demás proteínas del huésped (paso 2). Esto se debe a la baja tendencia de Strep-Tactin a unirse a proteínas de forma inespecífica. A continuación, la proteína de fusión Strep-tag purificada se eluye suavemente con una baja concentración de desthiobiotina , que compite específicamente por el sitio de unión de la biotina (paso 3). Para regenerar la columna, la desthiobiotina se elimina mediante la aplicación de una solución que contiene HABA (un colorante azoico amarillo ). La eliminación de la desthiobiotina se indica mediante un cambio de color de amarillo-naranja a rojo (pasos 4 y 5). Finalmente, la solución de HABA se enjuaga con un pequeño volumen de tampón de corrida, dejando así la columna lista para su uso en la siguiente ronda de purificación.

El sistema Strep-tag ofrece una herramienta selectiva para purificar proteínas en condiciones fisiológicas. Las proteínas obtenidas son bioactivas y presentan una pureza muy alta (superior al 95%). Además, el sistema Strep-tag puede utilizarse para la detección de proteínas en diversos ensayos. Según las circunstancias experimentales, se pueden emplear anticuerpos Strep-tag o Strep-Tactin, con un marcador enzimático (p. ej. , peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP)) o fluorescente (p. ej., proteína verde fluorescente (GFP)). Si se requiere una alta pureza, el lisado puede purificarse primero con Strep-Tactin y luego realizar una segunda purificación con anticuerpos contra Strep-tag. Esto reduce la contaminación con proteínas unidas inespecíficamente, que podría ocurrir en algunos casos excepcionales.

Utilizando el sistema de detección Strep-tag se pueden realizar los siguientes ensayos:

• purificación por afinidad en un solo paso
• Estudios de interacción proteína-proteína
• transferencia de colonias , transferencia de puntos , transferencia Western y ELISA
• Detección de clones con expresión positiva
• Inmunocitoquímica e inmunohistoquímica
• Estudios de localización y direccionamiento de proteínas

Dado que la etiqueta Strep-tag permite aislar complejos proteicos, también se pueden desarrollar estrategias para el estudio de las interacciones proteína-proteína. Otra opción es la inmovilización de proteínas con etiqueta Strep-tag mediante un anticuerpo específico de alta afinidad en microplacas o biochips.

El sistema Strep-Tag/StrepTactin también se utiliza en experimentos con pinzas ópticas de molécula única y microscopios de fuerza atómica , mostrando una alta estabilidad mecánica comparable a la de los enlaces no covalentes más fuertes disponibles actualmente. ^{[ 6 ]}

• Estreptomero
• Etiqueta de proteína
• SpyTag

• La etiqueta de estreptococo