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La etiqueta FLAG , o octapéptido FLAG , o epítopo FLAG , es una etiqueta de proteína peptídica que se puede agregar a una proteína usando tecnología de ADN recombinante , con la...

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La etiqueta FLAG , o octapéptido FLAG , o epítopo FLAG , es una etiqueta de proteína peptídica que se puede agregar a una proteína usando tecnología de ADN recombinante , con la secuencia DYKDDDDK (donde D = ácido aspártico , Y = tirosina y K = lisina ). [ 1 ] Es una de las etiquetas más específicas [ 2 ] y es un antígeno artificial para el cual se han desarrollado anticuerpos monoclonales específicos de alta afinidad y, por lo tanto, se puede usar para la purificación de proteínas por cromatografía de afinidad y también se puede usar para localizar proteínas dentro de células vivas. La etiqueta FLAG se ha utilizado para separar la proteína recombinante sobreexpresada de la proteína de tipo silvestre expresada por el organismo huésped. La etiqueta FLAG también se puede usar en el aislamiento de complejos proteicos con múltiples subunidades, porque el procedimiento de purificación suave de la etiqueta FLAG tiende a no desestabilizar dichos complejos. La purificación basada en la etiqueta FLAG se ha utilizado para obtener proteínas con la pureza y calidad suficientes para llevar a cabo la determinación de la estructura 3D mediante cristalografía de rayos X.

Una etiqueta FLAG puede utilizarse en diversos ensayos que requieren el reconocimiento por un anticuerpo . Si no existe un anticuerpo contra una proteína determinada, añadir una etiqueta FLAG a dicha proteína permite estudiarla con un anticuerpo dirigido contra la secuencia de la etiqueta FLAG. Algunos ejemplos son los estudios de localización celular mediante inmunofluorescencia , la inmunoprecipitación o la detección mediante electroforesis de proteínas SDS-PAGE y Western blot .

La secuencia peptídica de la etiqueta FLAG desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal es: DYKDDDDK (1012 Da). Además, las etiquetas FLAG pueden usarse en tándem, comúnmente el péptido 3xFLAG: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK (donde la etiqueta final codifica un sitio de escisión de enterocinasa). La etiqueta FLAG puede fusionarse al extremo C-terminal o al extremo N-terminal de una proteína, o insertarse dentro de ella. Algunos anticuerpos disponibles comercialmente (p. ej., M1/4E11) reconocen el epítopo solo cuando la etiqueta FLAG está presente en el extremo N-terminal. Sin embargo, otros anticuerpos disponibles (p. ej., M2) son insensibles a la posición. El residuo de tirosina en la etiqueta FLAG puede sulfatarse cuando se expresa en ciertas proteínas secretadas, lo que puede afectar el reconocimiento del epítopo FLAG por parte del anticuerpo. [ 3 ] La etiqueta FLAG se puede utilizar junto con otras etiquetas de afinidad, por ejemplo una etiqueta de polihistidina ( etiqueta His ), una etiqueta HA o una etiqueta myc .

Historia

El primer uso del etiquetado de epítopos fue descrito por Munro y Pelham en 1984. [ 4 ] La etiqueta FLAG fue el segundo ejemplo de una etiqueta de epítopo mejorada y completamente funcional, publicada en la literatura científica. [ 1 ] [ 5 ] [ 6 ] y fue la única etiqueta de epítopo patentada. [ 7 ] [ 8 ] Desde entonces, se ha convertido en una de las etiquetas de proteínas más utilizadas en laboratorios de todo el mundo. A diferencia de otras etiquetas (por ejemplo, myc, HA), donde primero se aisló un anticuerpo monoclonal contra una proteína existente, luego se caracterizó el epítopo y se utilizó como etiqueta, el epítopo FLAG fue un diseño artificial idealizado, al cual se generaron anticuerpos monoclonales. La secuencia de la etiqueta FLAG se optimizó para la compatibilidad con las proteínas a las que se une, ya que la etiqueta FLAG es más hidrofílica que otras etiquetas de epítopo comunes y, por lo tanto, es menos probable que reduzca la actividad de las proteínas a las que se une. Además, las etiquetas FLAG N-terminales se pueden eliminar fácilmente de las proteínas una vez aisladas, mediante tratamiento con la proteasa específica, la enterocinasa ( enteropeptidasa ).

El tercer informe sobre el etiquetado de epítopos ( etiqueta HA ), [ 9 ] apareció aproximadamente un año después de que se enviara por primera vez el sistema Flag.

Véase también

Referencias

  1. 1 2 Hopp TP, Prickett KS, Price VL, Libby RT, March CJ, Pat Cerretti D, Urdal DL, Conlon PJ (1988). "Una secuencia marcadora de polipéptido corta útil para la identificación y purificación de proteínas recombinantes". Bio/Technology . 6 (10): 1204– 10. doi : 10.1038/nbt1088-1204 . S2CID 205272216 . 
  2. ↑ "Cube Biotech" . Cube Biotech . Consultado el 13 de febrero de 2020 .
  3. ↑ Hunter MR, Grimsey NL, Glass M (2016). "La sulfatación del epítopo FLAG se ve afectada por la coexpresión de receptores acoplados a proteínas G en un modelo de células de mamíferos" . Scientific Reports . 6 27316. Bibcode : 2016NatSR...627316H . doi : 10.1038/srep27316 . PMC 4895180. PMID 27273047 .  
  4. ↑ Munro S, Pelham HR (1984). "Uso del etiquetado de péptidos para detectar proteínas expresadas a partir de genes clonados: mapeo de deleciones de dominios funcionales de hsp 70 de Drosophila" . The EMBO Journal . 3 (13): 3087– 93. doi : 10.1002/j.1460-2075.1984.tb02263.x . PMC 557822. PMID 6526011 .  
  5. ↑ Einhauer A, Jungbauer A (2001). "El péptido FLAG, una etiqueta de fusión versátil para la purificación de proteínas recombinantes". Journal of Biochemical and Biophysical Methods . 49 ( 1– 3): 455– 65. doi : 10.1016/S0165-022X(01)00213-5 . PMID 11694294 . 
  6. ↑ "Adición de un epítopo a una secuencia codificante de proteínas: etiqueta FLAG" . La lógica de los enfoques moleculares para los problemas biológicos . Universidad de Cornell.
  7. ↑ FLAG es una marca registrada de Sigma-Aldrich Co. LLC.
  8. ↑ Patente estadounidense 4703004 , Hopp, Thomas P; Bektesh, Susan y Conlon 3rd., Paul J et al., "Síntesis de proteína con un péptido de identificación", publicada el 27 de octubre de 1987, asignada a Immunex Corp. 
  9. ↑ Field J, Nikawa J, Broek D, MacDonald B, Rodgers L, Wilson IA, Lerner RA, Wigler M (1988). "Purificación de un complejo de adenilil ciclasa sensible a RAS de Saccharomyces cerevisiae mediante el uso de un método de adición de epítopos" . Biología Molecular y Celular . 8 (5): 2159– 65. doi : 10.1128/mcb.8.5.2159-2165.1988 . PMC 363397. PMID 2455217 .