Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

FRET de molécula única

La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de molécula única (o Förster) (o smFRET ) es una técnica biofísica que se utiliza para medir distancias a escala de 1...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita

La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de molécula única (o Förster) (o smFRET ) es una técnica biofísica que se utiliza para medir distancias a escala de 1 a 10 nanómetros en moléculas individuales , típicamente biomoléculas . Es una aplicación de FRET en la que un par de fluoróforos donador y aceptor se excitan y detectan a nivel de molécula única. A diferencia de "FRET de conjunto", que proporciona la señal FRET de un gran número de moléculas, FRET de molécula única permite resolver la señal FRET de cada molécula individual. La variación de la señal smFRET es útil para revelar información cinética que una medición de conjunto no puede proporcionar, especialmente cuando el sistema está en equilibrio sin cambios en la señal global/de conjunto. También se puede observar la heterogeneidad entre diferentes moléculas. Este método se ha aplicado en numerosas mediciones de dinámica intramolecular, como el plegamiento/desplegamiento de ADN/ARN/proteínas y otros cambios conformacionales, y de dinámica intermolecular, como la reacción, la unión, la adsorción y la desorción , que resultan especialmente útiles en la detección química, los bioensayos y la biodetección.

Metodología

Esquema de un experimento típico de smFRET (A), curva de distancia FRET. r es la distancia promedio entre los dos colorantes durante el tiempo de recolección de un punto de datos. (B), y una trayectoria temporal (C).

Las mediciones FRET de molécula única se realizan típicamente en microscopios de fluorescencia , ya sea utilizando moléculas inmovilizadas en la superficie o moléculas que se difunden libremente. Los pares FRET individuales se iluminan con fuentes de luz intensas, generalmente láseres , para generar señales de fluorescencia suficientes que permitan la detección de moléculas individuales. La microscopía multifotónica de campo amplio se combina típicamente con la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) . Esto excita selectivamente los pares FRET en la superficie de la cámara de medición y rechaza el ruido del volumen de la muestra. Alternativamente, la microscopía confocal minimiza el fondo al enfocar la luz de fluorescencia en un orificio para rechazar la luz desenfocada. [ 1 ] El volumen confocal tiene un diámetro de alrededor de 220  nm, por lo que debe escanearse si se necesita una imagen de la muestra. Con la excitación confocal, es posible medir a mayor profundidad en la muestra que cuando se utiliza TIRF. La señal de fluorescencia se detecta mediante cámaras CCD ultrasensibles o cámaras CMOS científicas para microscopía de campo amplio, o mediante SPAD para microscopía confocal. [ 2 ] Una vez que se dispone de las intensidades de moléculas individuales en función del tiempo, se puede calcular la eficiencia FRET para cada par FRET en función del tiempo, lo que permite seguir los eventos cinéticos a escala de molécula individual y construir histogramas FRET que muestran la distribución de estados en cada molécula. Sin embargo, es necesario registrar y combinar datos de muchos pares FRET para obtener información general sobre una muestra [ 3 ] o una estructura dinámica. [ 4 ]

Inmovilizado en superficie

En experimentos con inmovilización en superficie, las biomoléculas marcadas con etiquetas fluorescentes se unen a la superficie del cubreobjetos y se adquieren imágenes de fluorescencia (normalmente mediante cámaras CCD o CMOS científicas ). [ 5 ] La recopilación de datos con cámaras produce vídeos de la muestra que deben procesarse para obtener las intensidades de las moléculas individuales a lo largo del tiempo. Si se utiliza un microscopio confocal con detector SPAD , primero se realiza la búsqueda de moléculas escaneando la muestra. A continuación, el punto confocal se sitúa sobre una molécula y recoge directamente los datos de intensidad-tiempo, siempre que la deriva de la muestra sea despreciable, o bien se utiliza un bucle de retroalimentación activa para seguir la molécula.

Una ventaja de los experimentos con moléculas inmovilizadas en superficie es que se pueden observar muchas moléculas en paralelo durante un periodo prolongado hasta el fotoblanqueo (normalmente de 1 a 30 s). Esto permite estudiar con facilidad las transiciones que tienen lugar en escalas de tiempo lentas. Una desventaja reside en las modificaciones bioquímicas adicionales necesarias para unir las moléculas a la superficie y en las posibles perturbaciones que esta puede ejercer sobre la actividad molecular. Además, la resolución temporal máxima de las intensidades de moléculas individuales está limitada por el tiempo de adquisición de la cámara (normalmente >1 ms).

Difusión libre

La técnica SmFRET también puede utilizarse para estudiar las conformaciones de moléculas que se difunden libremente en una muestra líquida. En los experimentos de smFRET de difusión libre (o smFRET basado en difusión), las mismas biomoléculas se difunden libremente en la solución mientras son excitadas por un pequeño volumen de excitación (generalmente un punto limitado por difracción ). Los pulsos de fotones producidos por una sola molécula que cruza el punto de excitación se adquieren con detectores SPAD . El punto confocal suele estar fijo en una posición determinada (no se realiza ningún escaneo ni se adquiere ninguna imagen). En su lugar, los fotones de fluorescencia emitidos por moléculas individuales que cruzan el volumen de excitación se registran y acumulan para construir una distribución de las diferentes poblaciones presentes en la muestra. Dependiendo de la complejidad de esta distribución, los tiempos de adquisición varían desde aproximadamente 5 minutos hasta varias horas.

Una ventaja distintiva de los sistemas que emplean detectores SPAD es que no están limitados por una " velocidad de fotogramas " ni por un tiempo de integración fijo, como ocurre con las cámaras. De hecho, a diferencia de las cámaras, los SPAD generan un pulso cada vez que se detecta un fotón, mientras que se necesita electrónica adicional para "marcar con una marca de tiempo" cada pulso con una resolución de 10 a 50 ns. La alta resolución temporal de las mediciones FRET de molécula única confocales permite a los observadores detectar potencialmente dinámicas en escalas de tiempo tan bajas como 10 μs. Sin embargo, detectar transiciones "lentas" en escalas de tiempo mayores que el tiempo de difusión (típicamente ~1 ms) es más difícil que en los experimentos con moléculas inmovilizadas en superficie y generalmente requiere adquisiciones mucho más largas.

Normalmente, la emisión fluorescente de los fluoróforos donador y aceptor se detecta mediante dos detectores independientes, y la señal FRET se calcula a partir de la relación de intensidades en los dos canales. Algunas configuraciones dividen cada canal espectral (donador o aceptor) en dos polarizaciones ortogonales (lo que requiere cuatro detectores) y permiten medir simultáneamente la anisotropía de fluorescencia y la FRET . En otras configuraciones, se adquieren tres o cuatro canales espectrales a la vez para medir múltiples pares FRET simultáneamente. Se pueden utilizar láseres de onda continua (CW) o pulsados ​​como fuentes de excitación. Al utilizar láseres pulsados, un hardware de adquisición adecuado puede medir el tiempo de llegada del fotón con respecto al último pulso láser con resolución de picosegundos, en la denominada adquisición de conteo de fotones individuales correlacionados en el tiempo (TCSPC). En esta configuración, cada fotón se caracteriza por un macrotiempo (es decir, una marca de tiempo aproximada de 10 a 50 ns) y un microtiempo (es decir, un retardo con respecto al último pulso láser). Este último método puede utilizarse para extraer información sobre el tiempo de vida y obtener la señal FRET.

Análisis de datos

Los datos típicos de smFRET de un sistema de dos colorantes son las trayectorias temporales de las intensidades de emisión de fluorescencia del colorante donador y del colorante aceptor, denominadas dos canales. Principalmente se utilizan dos métodos para obtener la emisión de los dos colorantes: (1) la medición acumulativa utiliza un tiempo de exposición fijo de las cámaras para cada fotograma, como PMT, APD, EMCCD y cámaras CMOS; (2) la secuencia temporal de llegada de fotones individuales se mide utilizando detectores PMT o APD. El principio consiste en utilizar filtros ópticos o espejos dicroicos para separar las emisiones de los dos colorantes y medirlas en dos canales. Por ejemplo, en la literatura se describe una configuración que utiliza las dos mitades de una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD). [ 6 ]

Para un sistema de dos colorantes, las señales de emisión se utilizan para calcular la eficiencia FRET entre los colorantes a lo largo del tiempo. La eficiencia FRET es el número de fotones emitidos por el colorante aceptor dividido por la suma de las emisiones del colorante donante y el aceptor. Las trayectorias temporales producidas en cada experimento pueden contener señales de etiquetado incompleto o incorrecto, o incluso agregados. Para tener esto en cuenta, varios grupos de investigación han desarrollado herramientas sofisticadas para la selección de trazas temporales basadas en múltiples métricas, [ 7 ] [ 8 ] o utilizando redes neuronales profundas. [ 9 ] Normalmente, solo se excita el colorante donante, pero se puede obtener información aún más precisa si se excitan alternativamente el colorante donante y el aceptor. [ 10 ] En un esquema de excitación simple, la emisión de los colorantes donante y aceptor es simplemente el número de fotones recolectados para los dos colorantes dividido por las eficiencias de recolección de fotones de los dos canales respectivamente, que son funciones de la eficiencia de recolección, la eficiencia del filtro y óptica, y la eficiencia de la cámara de las dos bandas de longitud de onda. Estas eficiencias pueden calibrarse para una configuración instrumental determinada.

FRmiT=IAηAQAIAηAQA+IDηDQD=IAIA+γID{\displaystyle FRET={\frac {\tfrac {I_{A}}{\eta _{A}Q_{A}}}{{\tfrac {I_{A}}{\eta _{A}Q_{A}}}+{\tfrac {I_{D}}{\eta _{D}Q_{D}}}}}={\frac {I_{A}}{{I_{A}}+\gamma {I_{D}}}}}

donde FRET es la eficiencia FRET del sistema de dos colorantes en un período de tiempo,IA{\displaystyle I_{A}}yID{\displaystyle I_{D}}son recuentos de fotones medidos del canal aceptor y donador respectivamente en el mismo período de tiempo,ηA{\displaystyle \eta _{A}}yηD{\displaystyle \eta _{D}}son las eficiencias de recolección de fotones de los dos canales,QA{\displaystyle Q_{A}}yQD{\displaystyle Q_{D}}son el rendimiento cuántico de los dos colorantes, yγ{\displaystyle \gamma }es una corrección a la diferente luminosidad intrínseca de los dos tintes en la configuración del microscopio. Por lo tanto,I/η{\displaystyle I/\eta }calcula el número real de fotones emitidos por el colorante. Si las eficiencias de recolección de fotones de los dos canales son similares y no interesa la distancia FRET real, se pueden configurar los dosη{\displaystyle \eta }= 1, y los dos rendimientos cuánticos también dan 1, es decir,γ=1{\displaystyle \gamma =1}.

(A) Ejemplo de trayectoria temporal de los recuentos de fotones de los canales aceptor (rojo) y donador (azul) recopilados con una resolución temporal de 1 ms. (B) Los datos se agruparon en intervalos de 10 ms para reducir el ruido. El recuadro muestra la trayectoria temporal de smFRET calculada con la ecuación. La parte de mayor número de fotocuentos presenta un ruido elevado, dominado por ruido gaussiano dependiente del número de fotocuentos, mientras que la zona de menor número de fotocuentos está dominada por ruido de Poisson.

En los datos de emisión acumulativa smFRET, las trayectorias temporales contienen principalmente la siguiente información: (1) transiciones de estado, (2) ruido, (3) desenfoque de la cámara (análogo al desenfoque por movimiento ), (4) fotoparpadeo y fotoblanqueo de los colorantes. La información sobre las transiciones de estado es la que se busca en una medición típica. Sin embargo, las demás señales interfieren con el análisis de datos y, por lo tanto, deben ser tratadas.

En el sitio web de KinSoftChallenge se puede encontrar una lista de paquetes de software. [ 11 ] Aquí se puede encontrar un informe sobre los resultados de la comparación entre estos paquetes de software. [ 12 ] [ 13 ]

Ruido

La señal de ruido de la emisión del colorante generalmente contiene ruido de lectura de la cámara, ruido de disparo y ruido blanco , y ruido de la muestra real, cada uno siguiendo una distribución de ruido diferente debido a las distintas fuentes. El ruido de la muestra real proviene de la perturbación térmica del sistema que produce un ensanchamiento de la distancia FRET, una distribución desigual de la orientación del colorante, variaciones en la emisión del colorante, parpadeo rápido y cinética más rápida que el tiempo de integración. Las variaciones lentas de la emisión del colorante probablemente se consideren estados falsos positivos que deben evitarse experimentalmente eligiendo diferentes colorantes. Los otros ruidos provienen de la ruta de excitación y la ruta de detección, especialmente de la cámara. En última instancia, el ruido de los datos de emisión brutos es una combinación de ruidos con distribución de Poisson y distribución gaussiana . El ruido en cada canal a veces (por ejemplo, para detectores de fotones individuales) se puede simplificar a la suma de un ruido gaussiano dependiente de la intensidad (cuanto mayor sea el conteo, mayor será el ruido; es una combinación de ruido gaussiano y ruido de Poisson de mayor amplitud que se puede representar mediante la función gaussiana) y un ruido de fondo de Poisson (independiente del conteo de señal). Este último ruido predomina cuando el canal está apagado o en estado de baja intensidad (figura derecha). El ruido se puede aproximar a una distribución gaussiana, especialmente con conteos de señal relativamente altos. El ruido en los dos canales se combina entonces en la ecuación no lineal mencionada anteriormente para calcular los valores FRET. Por lo tanto, el ruido en las trayectorias smFRET es muy complejo. El ruido es asimétrico por encima y por debajo de los valores FRET medios y su magnitud cambia hacia los dos extremos (0 y 1) de los valores FRET debido a las incertidumbres cambiantes de los canales A y D. La mayor parte del ruido se puede reducir agrupando los datos (véase la figura), aunque esto conlleva una pérdida de resolución temporal. Consulte GitHub (postFRET) para ver un ejemplo de códigos MATLAB para simular trayectorias temporales de smFRET con y sin ruido (enlace de GitHub [ 14 ] ).

Desenfoque de la cámara

Desenfoque de cámara simulado con un ejemplo de smFRET de 3 estados usando el simulador postFRET [ 14 ] (dos simulaciones). La relación señal/ruido se establece en aproximadamente 20 para ambas simulaciones. La resolución temporal se simula a 1 ms y luego se agrupa a 10 ms, el tiempo de integración de los experimentos simulados. Las constantes de velocidad de simulación se enumeran a la izquierda, una pequeña parte de la trayectoria se muestra en el centro (los colores alternos representan diferentes moléculas) y el histograma FRET de todas las moléculas (100) se muestra a la derecha.

La señal de desenfoque de la cámara proviene de la naturaleza discreta de las mediciones. La señal de emisión presenta una discrepancia con la señal de transición real debido a que una o ambas son estocásticas (aleatorias). Cuando se produce una transición de estado entre la lectura de dos intervalos de lectura de emisión, la señal es el promedio de las dos partes en la misma ventana de medición, lo que afecta la precisión de la identificación del estado y, finalmente, el análisis de la constante de velocidad. Esto no representa un problema significativo cuando la frecuencia de medición es mucho mayor que la tasa de transición, pero se convierte en un problema real cuando se aproximan (figura de la derecha). Para reflejar el efecto de desenfoque de la cámara en las trayectorias smFRET simuladas, es necesario simular los datos con una resolución temporal mayor (por ejemplo, 10 veces más rápida) que el tiempo de adquisición de datos y, posteriormente, agrupar los datos en las trayectorias finales. Consulte GitHub (postFRET) [ 14 ] para ver un ejemplo de código MATLAB para simular trayectorias temporales smFRET con una resolución temporal mayor y luego agruparlas a la resolución temporal de medición (tiempo de integración) para simular el efecto de desenfoque de la cámara.

Fotoparpadeo y fotoblanqueamiento

Las trayectorias temporales también contienen información sobre el fotoparpadeo y el fotoblanqueo de los dos colorantes. Esta información debe eliminarse, lo que crea huecos en la trayectoria temporal donde se pierde la información de FRET. La información sobre el fotoparpadeo y el fotoblanqueo puede eliminarse para un sistema de colorante típico con intervalos de fotoparpadeo y tiempos de vida de fotoblanqueo relativamente largos, como los que se han elegido en la medición. Por lo tanto, no representan un problema importante para el análisis de datos. Sin embargo, se convertirá en un gran problema si se utiliza un colorante con intervalos de parpadeo cortos o un tiempo de vida en estado oscuro prolongado. Se han desarrollado soluciones químicas específicas para mitigar estos dos problemas, como soluciones captadoras de oxígeno o desactivadores del estado triplete .

Algoritmos de identificación de estados

Se han desarrollado varios métodos de análisis de datos para analizar los datos, como métodos de umbralización, métodos de modelo oculto de Markov (HMM) y métodos de identificación de puntos de transición. Los métodos de umbralización simplemente establecen un umbral entre dos estados adyacentes en las trayectorias smFRET. Los valores FRET por encima del umbral pertenecen a un estado y los valores por debajo pertenecen a otro. Este método funciona para datos con una relación señal-ruido muy alta , por lo que tienen estados FRET distinguibles. Este método es intuitivo y tiene una larga historia de aplicaciones. Se puede encontrar un ejemplo de código fuente en el software postFRET. [ 14 ] Los HMM se basan en algoritmos que calculan estadísticamente funciones de probabilidad de cada asignación de estado, es decir, agregan penalizaciones a una asignación menos probable. Los paquetes de software típicos de código abierto se pueden encontrar en línea como HaMMy, vbFRET, ebFRET, SMART, SMACKS, MASH-FRET, etc. [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] El análisis de puntos de transición o análisis de puntos de cambio (CPA) utiliza algoritmos para identificar cuándo ocurre una transición a lo largo de la trayectoria temporal utilizando análisis estadístico. Por ejemplo, el CPA basado en la teoría de la información de Fisher y el método de prueba t de Student ( STaSI , código abierto, enlace de GitHub [ 18 ] [ 19 ] ) identifica transiciones de estado y minimiza la longitud de la descripción seleccionando el número óptimo de estados, es decir, equilibrando la penalización del ruido y el número total de estados.

Análisis de tasas

Ejemplos de redes de reacción con diferente número de estados smFRET. Las constantes de velocidad pueden ser iguales a cero cuando las transiciones están prohibidas entre algunos estados que se pueden medir en smFRET.

Una vez identificados los estados, se pueden utilizar para calcular las distancias de transferencia de energía de resonancia de Förster y las constantes de velocidad de transición entre ellos. Para una matriz de reacción paralela entre los estados, las constantes de velocidad de cada transición no se pueden obtener a partir de las vidas medias de cada transición, que se fijan como la suma inversa de las constantes de velocidad. Las vidas medias de las transiciones de un estado a todos los demás estados son todas "iguales" para una sola molécula. Sin embargo, las constantes de velocidad se pueden calcular a partir de las funciones de probabilidad, el número de cada transición sobre el tiempo total del estado desde el que se transfiere. [ 20 ]

kiF=norteiF∑F=1F=nortetiF=norteiFti{\displaystyle k_{if}={\frac {N_{if}}{\sum _{f=1}^{f=n}t_{if}}}={\frac {N_{if}}{t_{i}}}}
Un ejemplo de trayectoria identificada por estado y el histograma del tiempo de permanencia de cada transición. La vida útil es el promedio de todos los tiempos de permanencia, que es el inverso de la suma de todas las constantes de velocidad del estado a otros estados.

donde i es el estado inicial, f es el estado final de la transición, N es el número de estas transiciones en las trayectorias temporales, n es el número total de estados, k es la constante de velocidad, t es el tiempo de cada estado antes de que ocurra la transición. Por ejemplo, se miden 130 segundos (s) de trayectorias temporales de smFRET. El tiempo total que una molécula permanece en el estado uno es t 1 = 100 segundos (s), en el estado dos t 2 = 20 s, y en el estado tres es t 3 = 10 s. Entre los 100 s la molécula permanece en el estado uno, se transfiere al estado dos 70 veces y se transfiere al estado tres 30 veces al final de sus tiempos de permanencia, la constante de velocidad del estado 1 al estado 2 es, por lo tanto, k 12 = 70/100 = 0,7 s −1 , la constante de velocidad del estado 1 al estado 3 es k 13 = 30/100 = 0,3 s −1 . Típicamente, las probabilidades de las longitudes de las 70 veces o las 30 veces transición (tiempos de permanencia) están distribuidas exponencialmente (figura de la derecha). Los tiempos de permanencia promedio de las dos distribuciones del estado uno, es decir, las dos vidas medias, τ 12 y τ 13 , son ambas iguales a 1 s para estas dos transiciones (figura de la derecha). El número de transiciones N puede ser el número total de transiciones de estado o la amplitud ajustada de la función de decaimiento exponencial del histograma acumulado de los tiempos de permanencia de los estados. Esta última solo funciona para distribuciones de tiempos de permanencia bien definidas. Un sistema en equilibrio, donde cada estado se transfiere en paralelo a todos los demás mediante reacciones de primer orden, es un caso especial que facilita la comprensión. Cuando el sistema no está en equilibrio, esta ecuación sigue siendo válida, pero debe utilizarse con precaución.

La interpretación de la ecuación anterior se basa simplemente en la suposición de que cada molécula es la misma, la hipótesis ergódica . La existencia de cada estado se representa simplemente por su tiempo total, que es su "concentración". Por lo tanto, la tasa de transición a cualquier otro estado es el número de transiciones normalizado por esta concentración. Numéricamente, la concentración de tiempo se puede convertir en concentración numérica para imitar una medición de conjunto. [ 20 ] Debido a que las moléculas individuales son iguales a todas las demás moléculas, podemos suponer que la trayectoria temporal es una combinación aleatoria de muchas moléculas, cada una ocupando solo un período de tiempo muy corto, digamos 𝛿 t . Por lo tanto, la "concentración" de la molécula en el estado n es c n = t n / 𝛿 t . Entre todas estas "moléculas", si N nf se transfieren al estado f durante este tiempo de medición 𝛿 t , la tasa de transferencia por definición es r = N nf / 𝛿 t = k nf c n . Por lo tanto, k nf = N nf / t n .

Se observa que la medición de la constante de velocidad a nivel de molécula individual depende únicamente de la hipótesis ergódica, la cual puede evaluarse si se mide un número estadísticamente suficiente de moléculas individuales y se observan distribuciones de tiempos de permanencia predecibles. También puede observarse heterogeneidad entre moléculas individuales si cada molécula presenta un conjunto distinguible de estados o de constantes de velocidad.

Reducir el nivel de incertidumbre

El nivel de incertidumbre del análisis de tasas se puede estimar a partir de múltiples ensayos experimentales, análisis de remuestreo (bootstrapping ) y análisis de errores de ajuste. La asignación incorrecta de estados es una fuente común de errores durante el análisis de datos, que se origina por la ampliación de estados, el ruido y el desenfoque de la cámara. El agrupamiento de datos , el promedio móvil y la transformada wavelet pueden ayudar a reducir el efecto de la ampliación de estados y el ruido, pero aumentarán el efecto de desenfoque de la cámara.

El efecto de desenfoque de la cámara se puede reducir mediante una frecuencia de muestreo más rápida, lo que depende del desarrollo de una cámara más sensible, un análisis de datos especial o ambos. Tradicionalmente, en los HMM, el punto de datos antes y después de la transición se asigna especialmente para reducir la tasa de asignación errónea de estos puntos de datos a estados entre la transición. Sin embargo, este método tiene una limitación. Cuando la frecuencia de transición se acerca a la frecuencia de muestreo, se desenfocan demasiados datos para que este método funcione (véase la figura anterior del desenfoque de la cámara). Se ha informado de un enfoque experimental que utiliza un láser pulsado para superar parcialmente el efecto de desenfoque de la cámara sin una cámara muy rápida. [ 21 ] La idea es iluminar solo un período muy corto en cada ciclo de adquisición de la cámara para evitar el promedio de la señal en cada ciclo.

También se ha descrito un método de análisis de datos en dos pasos para aumentar la precisión del análisis de datos borrosos de la cámara. La idea consiste en simular una trayectoria con el método de simulación de Monte Carlo y compararla con los datos experimentales. En las condiciones adecuadas, tanto la simulación como los datos experimentales contendrán el mismo grado de información de desenfoque y ruido. Esta trayectoria simulada es una mejor respuesta que los datos experimentales sin procesar porque su verdad fundamental es "conocida". Este método cuenta con códigos de código abierto disponibles como postFRET [ 22 ] (enlace de GitHub [ 14 ] ) y MASH-FRET [ 16 ] . Este método también puede corregir ligeramente el efecto del ruido no gaussiano que ha causado problemas para identificar con precisión los estados utilizando métodos estadísticos.

El análisis de datos actual para smFRET todavía requiere mucho cuidado y capacitación especial, lo que exige que los algoritmos de aprendizaje profundo desempeñen un papel importante para reducir el trabajo en el análisis de datos.

Ventajas

Comparación de los resultados esquemáticos de las mediciones de FRET en masa (naranja), en conjunto (negro) y smFRET de un sistema con tres estados (1-3). La medición en masa promedia todos los estados, la medición en conjunto suma todos los estados y smFRET resuelve cada estado contando la población de moléculas en cada estado a lo largo del tiempo. La información cinética está oculta en las mediciones en masa y en conjunto, pero puede observarse en la medición smFRET analizando las transiciones entre cada estado a lo largo del tiempo.

La técnica SmFRET permite un análisis más preciso de poblaciones heterogéneas y presenta algunas ventajas en comparación con la técnica FRET de conjunto.

Una ventaja de estudiar las distancias en moléculas individuales es que las poblaciones heterogéneas pueden estudiarse con mayor precisión mediante valores específicos para cada molécula, en lugar de calcular un promedio basado en un conjunto. Esto permite el estudio de poblaciones homogéneas específicas dentro de una población heterogénea. Por ejemplo, si dos poblaciones homólogas existentes dentro de una población heterogénea tienen valores FRET diferentes, un análisis FRET de conjunto producirá un valor FRET promedio ponderado para representar la población en su conjunto. Por lo tanto, el valor FRET obtenido no proporciona datos sobre las dos poblaciones distintas. En cambio, smFRET podría diferenciar entre las dos poblaciones y permitiría un análisis de las poblaciones homólogas existentes. [ 23 ]

SmFRET también proporciona una resolución temporal dinámica de una molécula individual que no se puede lograr mediante mediciones FRET de conjunto. El FRET de conjunto tiene la capacidad de detectar estados de transición bien poblados que se acumulan en una población, pero carece de la capacidad de caracterizar intermedios que son de corta duración y no se acumulan. Esta limitación se resuelve con smFRET, que ofrece una forma directa de observar los intermedios de moléculas individuales independientemente de su acumulación. Cuando se observa una molécula durante un tiempo suficientemente prolongado, habrá eventos del estado de transición que durarán lo suficiente como para distinguirlos del ruido o del ensanchamiento de otros estados. Por lo tanto, smFRET demuestra la capacidad de capturar subpoblaciones transitorias en un entorno heterogéneo. [ 24 ]

La información cinética en un sistema en equilibrio se pierde a nivel de conjunto porque ninguna de las concentraciones de reactivos y productos cambia con el tiempo. Sin embargo, a nivel de molécula individual, la transferencia entre reactivos y productos puede ocurrir a una velocidad alta y medible y mantenerse estocásticamente equilibrada con el tiempo. Por lo tanto, el seguimiento de la trayectoria temporal de una molécula en particular permite la medición directa de la constante de velocidad de cada paso de transición, incluyendo los intermedios que permanecen ocultos a nivel de conjunto debido a sus bajas concentraciones. Esto permite utilizar smFRET para estudiar la dinámica de plegamiento del ADN , el ARN y las proteínas . Al igual que el plegamiento de las proteínas , el plegamiento del ADN y el ARN pasa por múltiples interacciones, vías de plegamiento e intermedios antes de alcanzar sus estados nativos.

También se ha demostrado que SmFRET utiliza un sistema de tres colores mejor que FRET de conjunto. Al usar dos fluoróforos aceptores en lugar de uno, FRET puede observar múltiples sitios para movimientos correlacionados y cambios espaciales en cualquier molécula compleja. Esto se muestra en la investigación sobre la unión de Holliday . SmFRET con el sistema de tres colores ofrece información sobre los movimientos sincronizados de los tres sitios helicoidales de la unión y la casi inexistencia de sus estados paralelos. FRET de conjunto también puede usar un sistema de tres colores. Sin embargo, cualquier ventaja obvia se ve contrarrestada por los requisitos del sistema de tres colores, incluida una clara separación de las señales de los fluoróforos. Para una clara distinción de la señal, las superposiciones de FRET deben ser pequeñas, pero esto también debilita la fuerza de FRET. SmFRET corrige sus limitaciones de superposición mediante el uso de filtros de paso de banda y espejos dicroicos que amplían la señal entre dos aceptores de fluorescencia y resuelven cualquier efecto de solapamiento. [ 25 ]

Aplicaciones

Una aplicación importante de smFRET es analizar los matices bioquímicos minúsculos que facilitan el plegamiento de proteínas . En los últimos años, se han desarrollado múltiples técnicas para investigar las interacciones de moléculas individuales involucradas en el plegamiento y desplegamiento de proteínas. Las técnicas de sonda de fuerza , que utilizan microscopía de fuerza atómica y pinzas láser , han proporcionado información sobre la estabilidad de las proteínas. smFRET permite a los investigadores estudiar las interacciones moleculares mediante fluorescencia. La transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) fue aplicada por primera vez a moléculas individuales por Ha et al. y al plegamiento de proteínas en el trabajo de Hochstrasser, Weiss et al. El beneficio que smFRET en su conjunto ha brindado para analizar las interacciones moleculares es la capacidad de probar interacciones de moléculas individuales directamente sin tener que promediar conjuntos de datos. En el análisis del plegamiento de proteínas, los experimentos de conjunto implican tomar mediciones de múltiples proteínas que se encuentran en varios estados de transición entre su estado plegado y desplegado . Cuando se promedia, la estructura de la proteína que se puede inferir del conjunto de datos solo proporciona un modelo estructural rudimentario del plegamiento de proteínas. Sin embargo, para comprender verdaderamente el plegamiento de las proteínas, es necesario descifrar la secuencia de eventos estructurales a lo largo de las vías de plegamiento entre los estados plegado y desplegado. Es en esta rama de investigación donde la técnica smFRET resulta altamente aplicable.

Los estudios FRET calculan las eficiencias FRET correspondientes como resultado de la observación en tiempo real de los eventos de plegamiento de proteínas . Estas eficiencias FRET se pueden utilizar para inferir las distancias entre moléculas en función del tiempo. A medida que la proteína transita entre los estados plegado y desplegado, las distancias correspondientes entre moléculas pueden indicar la secuencia de interacciones moleculares que conducen al plegamiento de la proteína. [ 26 ]

Otra aplicación de smFRET es para la dinámica de plegamiento de ADN y ARN. [ 27 ] Típicamente, dos ubicaciones diferentes de un nucleótido se marcan con los colorantes donador y aceptor. El cambio de distancia entre las dos ubicaciones cambia con el tiempo debido al plegamiento y desplegamiento del nucleótido más la difusión aleatoria de los dos puntos a lo largo del tiempo, dentro de cada ventana de medición y entre diferentes ventanas. Debido a la complejidad de la trayectoria de plegamiento/desplegamiento, es extremadamente difícil medir el proceso a nivel de conjunto. Por lo tanto, smFRET se convierte en una técnica clave en este campo. Además de los desafíos del análisis de datos de smFRET, un desafío es marcar múltiples posiciones de interés, otro es a partir de la dinámica de dos puntos para calcular las vías de plegamiento generales.

La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) también puede aplicarse para estudiar los cambios conformacionales de los motivos de canal relevantes en ciertos canales . Por ejemplo, los canales de potasio tetraméricos KirBac marcados se marcaron con fluoróforos donadores y aceptores en sitios específicos para comprender la dinámica estructural dentro de la membrana lipídica , lo que les permitió generalizar dinámicas similares para motivos similares en otros canales Kir eucariotas o incluso canales catiónicos en general. El uso de smFRET en este experimento permite visualizar los cambios conformacionales que no se pueden observar si las mediciones macroscópicas simplemente se promedian. Esto conducirá a un análisis de conjunto en lugar de un análisis de moléculas individuales y los cambios conformacionales internos, lo que nos permitirá generalizar dinámicas similares para motivos similares en otros canales eucariotas .

Se ha analizado exhaustivamente la dinámica estructural del canal KirBac tanto en estado abierto como cerrado, dependiendo de la presencia del ligando PIP2 . Parte de los resultados basados ​​en smFRET demostraron la rigidez estructural de la región extracelular . El filtro de selectividad y el bucle externo de la región del filtro de selectividad se marcaron con fluoróforos y se observó acoplamiento conformacional. Las trayectorias individuales de smFRET demostraron claramente una eficiencia FRET de alrededor de 0,8 sin fluctuaciones, independientemente del estado del canal. [ 28 ]

Recientemente, la técnica FRET de molécula única se ha aplicado para detectar cuantitativamente ADN diana y distinguir polimorfismos de un solo nucleótido. A diferencia de la técnica FRET de conjunto, la técnica FRET de molécula única permite la monitorización en tiempo real de los eventos de unión a la molécula diana. Además, el bajo nivel de ruido de fondo y la alta relación señal-ruido observados con la técnica FRET de molécula única dan lugar a una ultrasensibilidad (límite de detección en el rango femtomolar). Actualmente, se incorporan diferentes tipos de pasos de amplificación de señal para reducir aún más el límite de detección.

Limitaciones

A pesar de realizar estimaciones aproximadas, una limitación de smFRET es la dificultad de obtener la distancia correcta involucrada en la transferencia de energía. Requerir una estimación precisa de la distancia plantea un gran desafío, ya que la fluorescencia de los fluoróforos donador y aceptor, así como la transferencia de energía, dependen del entorno y de la orientación de los colorantes, la cual puede variar según la flexibilidad de la unión de los fluoróforos. Además, la distancia real de un estado dado puede ser dinámica y el valor medido representa la distancia promedio dentro del intervalo de tiempo de adquisición. Sin embargo, este problema no es particularmente relevante cuando la estimación de la distancia entre los dos fluoróforos no necesita determinarse con precisión exacta y absoluta. [ 6 ]

Extraer información cinética de un sistema biológico complejo con una tasa de transición de unos pocos milisegundos o menos sigue siendo un desafío. Las resoluciones temporales actuales de dichas mediciones suelen estar en el nivel de milisegundos, con algunos informes en el nivel de microsegundos. Existe una limitación teórica en la fotofísica de colorantes. La vida media del estado excitado de una molécula de colorante orgánico típica es de aproximadamente 1 nanosegundo. Para obtener confianza estadística en los valores de FRET, se requieren decenas o cientos de fotones, lo que sitúa la mejor resolución temporal posible en el orden de 1 microsegundo. Para alcanzar este límite, se requiere una luz muy intensa (densidad de potencia del orden de 1 × 10¹⁰ W m⁻² , 10⁷ sol , que se logra típicamente enfocando un haz láser con un microscopio), lo que a menudo causa fotodaño a las moléculas orgánicas. Otra limitación es la vida media de fotoblanqueo del colorante, que es función de la intensidad de la luz y del estrés oxidativo/reductor del entorno. La vida útil de fotoblanqueo de un colorante orgánico típico en condiciones experimentales habituales (densidad de potencia láser de tan solo unos pocos soles) es de unos pocos segundos, o de unos pocos minutos con la ayuda de soluciones captadoras de oxígeno. Por lo tanto, es difícil estudiar eventos cinéticos de más de unos pocos minutos con colorantes orgánicos. En su lugar, deben utilizarse otras sondas con vidas útiles más largas, como puntos cuánticos, puntos poliméricos y colorantes totalmente inorgánicos.

Referencias

  1. ↑ Moerner WE, Fromm DP (2003-08-01). "Métodos de espectroscopia y microscopía de fluorescencia de molécula única". Review of Scientific Instruments . 74 (8): 3597– 3619. Bibcode : 2003RScI...74.3597M . doi : 10.1063/1.1589587 . ISSN 0034-6748 . S2CID 11615310 .  
  2. ↑ Michalet X, Colyer RA, Scalia G, Ingargiola A, Lin R, Millaud JE, Weiss S, Siegmund OH, Tremsin AS, Vallerga JV, Cheng A, Levi M, Aharoni D, Arisaka K, Villa F, Guerrieri F, Panzeri F, Rech I, Gulinatti A, Zappa F, Ghioni M, Cova S (febrero de 2013). "Desarrollo de nuevos detectores de conteo de fotones para microscopía de fluorescencia de molécula única" . Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Serie B, Ciencias Biológicas . 368 (1611) 20120035. doi : 10.1098/rstb.2012.0035 . PMC 3538434. PMID 23267185 .  
  3. ↑ Ha T , Enderle T, Ogletree DF, Chemla DS, Selvin PR , Weiss S (junio de 1996). "Sondeo de la interacción entre dos moléculas individuales: transferencia de energía de resonancia de fluorescencia entre un único donador y un único aceptor" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 93 (13): 6264– 8. Bibcode : 1996PNAS...93.6264H . doi : 10.1073/pnas.93.13.6264 . PMC 39010 . PMID 8692803 .  
  4. ↑ Hellenkamp B, Wortmann P, Kandzia F, Zacharias M, Hugel T (febrero de 2017). "Estructura multidominio y dinámica correlacionada determinadas por redes FRET autoconsistentes" . Nature Methods . 14 (2): 176– 182. doi : 10.1038/nmeth.4081 . PMC 5289555. PMID 27918541 .  
  5. ↑ Kastantin M, Schwartz DK (diciembre de 2011). "Conectando conformaciones raras de ADN y dinámica de superficie mediante transferencia de energía de resonancia de molécula única" . ACS Nano . 5 (12): 9861–9 . Bibcode : 2011ACSNa...5.9861K . doi : 10.1021/ nn2035389 . PMC 3246573. PMID 21942411 .  
  6. 1 2 Roy R, Hohng S, Ha T (junio de 2008). "Una guía práctica para FRET de molécula única" . Nature Methods . 5 (6): 507– 16. Bibcode : 2008NatCB...5..507R . doi : 10.1038/nmeth.1208 . PMC 3769523. PMID 18511918 .  
  7. ↑ Preus S, Noer SL, Hildebrandt LL, Gudnason D, Birkedal V (julio de 2015). "iSMS: software de microscopía FRET de molécula única". Nature Methods . 12 (7): 593– 594. doi : 10.1038/nmeth.3435 . PMID 26125588. S2CID 30222505 .  
  8. ↑ Juette, Manuel F (febrero de 2016). "Imágenes de moléculas individuales de conjuntos moleculares en desequilibrio en la escala de tiempo de milisegundos" . Nature Methods . 13 (4): 341– 344. doi : 10.1038/nmeth.3769 . PMC 4814340. PMID 26878382 .  
  9. ↑ Thomsen J, Sletfjerding MB, Jensen SB, Stella S, Paul B, Malle MG, et al. (noviembre de 2020). "DeepFRET, un software para la clasificación rápida y automatizada de datos FRET de molécula única mediante aprendizaje profundo" . eLife . 9 e60404. doi : 10.7554/eLife.60404 . PMC 7609065. PMID 33138911 .   
  10. ↑ Hellemkamp B, Schmid S, et al. (septiembre de 2018). "Precisión y exactitud de las mediciones FRET de molécula única: un estudio comparativo multilaboratorio" . Nature Methods . 15 (9): 669– 676. doi : 10.1038/s41592-018-0085-0 . PMC 6121742. PMID 30171252 .   
  11. ↑ "KinSoftChallenge - herramientas" .
  12. ↑ Götz, Markus; Barth, Anders; Bohr, Søren S.-R.; Börner, Richard; Chen, Jixin; Cordés, Thorben; Erie, Dorothy A.; Gebhardt, cristiano; Hadzic, Mélodie CAS; Hamilton, George L.; Hatzakis, Nikos S.; Hugel, Thorsten; Kisley, Lidia; Cordero, Don C.; De Lannoy, Carlos; Mahón, Chelsea; Dunukara, Dushani; De Ridder, Dick; Sanabria, Hugo; Schimpf, Julia; Seidel, Claus AM; Sigel, Roland KO; Sletfjerding, Magnus Berg; Thomsen, Johannes; Vollmar, Léonie; Wanninger, Simón; Weninger, Keith R.; Xu, Pengning; Schmid, Sonja (2022). "Una evaluación comparativa a ciegas de herramientas de análisis para inferir constantes de velocidad cinética a partir de trayectorias FRET de molécula única" . Nature Communications . 13 (1) 5402. Bibcode : 2022NatCo..13.5402G . bioRxiv 10.1101/2021.11.23.469671 . doi : 10.1038/s41467-022-33023-3 . PMC 9474500. PMID 36104339 .   
  13. ↑ Götz M, Barth A, Bohr SS, Börner R, Chen J, Cordes T, Erie DA, Gebhardt C, Hadzic MC, Hamilton GL, Hatzakis NS, Hugel T, Kisley L, Lamb DC, de Lannoy C, Mahn C, Dunukara D, de Ridder D, Sanabria H, Schimpf J, Seidel CA, Sigel RK, Sletfjerding MB, Thomsen J, Vollmar L, Wanninger S, Weninger KR, Xu P, Schmid S (septiembre de 2022). "Una evaluación comparativa ciega de herramientas de análisis para inferir constantes de velocidad cinética a partir de trayectorias FRET de molécula única" . Nature Communications . 13 (1) 5402. Bibcode : 2022NatCo..13.5402G . doi : 10.1038/ s41467-022-33023-3 . PMC 9474500. PMID 36104339 .  
  14. 1 2 3 4 5 "GitHub - nkchenjx/PostFRET: Un método para ajustar datos FRET de molécula única con dos pasos para aumentar la precisión" . GitHub . 5 de noviembre de 2020.
  15. ↑ Danial JS, García-Sáez AJ (octubre de 2017). "Mejorando la certeza en la obtención de imágenes de moléculas individuales". Current Opinion in Structural Biology . 46 : 24–30 . doi : 10.1016/j.sbi.2017.04.007 . PMID 28482279 . 
  16. 1 2 Börner R, Kowerko D, Hadzic MC, König SL, Ritter M, Sigel RK (2018). "Simulaciones de experimentos de fluorescencia de molécula única basados ​​en cámaras" . PLOS ONE . 13 (4) e0195277. Bibcode : 2018PLoSO..1395277B . doi : 10.1371/journal.pone.0195277 . PMC 5898730. PMID 29652886 .  
  17. ↑ Schmid S, Goetz M, Hugel T (2016). "Análisis de molécula única más allá de los tiempos de permanencia: demostración y evaluación dentro y fuera del equilibrio" . Biophysical Journal . 111 (7): 1375– 1384. arXiv : 1605.08612 . Bibcode : 2016BpJ...111.1375S . doi : 10.1016 / j.bpj.2016.08.023 . PMC 5052450. PMID 27705761 .  
  18. ↑ "Código del buscador de estados FRET STaSI del Laboratorio Landes" . GitHub. 6 de marzo de 2019.
  19. ↑ Shuang B, Cooper D, Taylor JN, Kisley L, Chen J, Wang W, et al. (septiembre de 2014). "Fast Step Transition and State Identification (STaSI) for Discrete Single-Molecule Data Analysis" . The Journal of Physical Chemistry Letters . 5 (18): 3157– 3161. Bibcode : 2014JPCL....5.3157S . doi : 10.1021/ jz501435p . PMC 4167035. PMID 25247055 .   
  20. 1 2 Chen J, Pyle JR, Sy Piecco KW, Kolomeisky AB, Landes CF (julio de 2016). "Un método de dos pasos para el análisis de datos smFRET". The Journal of Physical Chemistry B . 120 (29): 7128– 7132. Bibcode : 2016JPCB..120.7128C . doi : 10.1021/acs.jpcb.6b05697 . PMID 27379815 . 
  21. ↑ Nicholson DA, Nesbitt DJ (2021). "Llevando las mediciones cinéticas de moléculas individuales basadas en cámaras al límite de adquisición de fotogramas con smFRET estroboscópico" . The Journal of Physical Chemistry B. 125 ( 23): 6080– 6089. Bibcode : 2021JPCB..125.6080N . doi : 10.1021/acs.jpcb.1c01036 . PMID 34097408. S2CID 235369132 .  
  22. ↑ Chen J, Pyle JR, Sy Piecco KW, Kolomeisky AB, Landes CF (julio de 2016). "Un método de dos pasos para el análisis de datos smFRET". The Journal of Physical Chemistry B. 120 ( 29): 7128–32 . Bibcode : 2016JPCB..120.7128C . doi : 10.1021/acs.jpcb.6b05697 . PMID 27379815. S2CID 4782546 .  
  23. ↑ Ha T (septiembre de 2001). "Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de molécula única". Methods . 25 (1): 78– 86. doi : 10.1006/meth.2001.1217 . PMID 11558999. S2CID 13893394 .  
  24. ↑ Hinterdorfer P, van Oijen A, eds. (2009). Manual de biofísica de una sola molécula (1ª ed.). Dordrecht: Springer. ISBN  978-0-387-76497-9.
  25. ↑ Hohng S, Joo C, Ha T (agosto de 2004). "FRET de tres colores de molécula única" . Biophysical Journal . 87 (2): 1328– 37. Bibcode : 2004BpJ....87.1328H . doi : 10.1529 / biophysj.104.043935 . PMC 1304471. PMID 15298935 .  
  26. ↑ Schuler B, Eaton WA (febrero de 2008). "Estudio del plegamiento de proteínas mediante FRET de molécula única" . Current Opinion in Structural Biology . 18 (1): 16– 26. doi : 10.1016/j.sbi.2007.12.003 . PMC 2323684. PMID 18221865 .  
  27. ↑ Chen J, Poddar NK, Tauzin LJ, Cooper D, Kolomeisky AB, Landes CF (25 de septiembre de 2014). "Estudios FRET de molécula única de la dinámica de desplegamiento de la horquilla TAR-ADN del VIH" . The Journal of Physical Chemistry B. 118 ( 42): 12130–12139 . Bibcode : 2014JPCB..11812130C . doi : 10.1021/jp507067p . PMC 4207534. PMID 25254491 .  
  28. ↑ Wang S, Vafabakhsh R, Borschel WF, Ha T, Nichols CG (enero de 2016). "Dinámica estructural de la activación del canal de potasio revelada por FRET de molécula única" . Nature Structural & Molecular Biology . 23 (1): 31– 36. doi : 10.1038/nsmb.3138 . PMC 4833211. PMID 26641713 .  
  • Laboratorio Nils Walter, Universidad de Michigan
  • Centro de Análisis de Moléculas Únicas en Tiempo Real (SMART), Universidad de Michigan
  • Laboratorio Ha, Facultad de Medicina Johns Hopkins
  • Laboratorio Blanchard, Universidad de Cornell
  • Grupo de Investigación Schuler, Universidad de Zúrich
  • Laboratorio Weninger, Universidad Estatal de Carolina del Norte
  • Grupo de Investigación Kapanidis, Universidad de Oxford
  • Grupo de Investigación Zhuang, Universidad de Harvard
  • Grupo de Investigación Schwartz, Universidad de Colorado en Boulder
  • Grupo de Investigación Landes, Universidad Rice
  • Grupo de Investigación Chen, Universidad de Ohio
  • Grupo de Investigación Yang, Universidad de Princeton
  • Grupo de Investigación Komatsuzaki, Universidad de Hokkaido
  • Grupo de Investigación Weiss, UCLA
  • Grupo de Investigación González, Universidad de Columbia
  • Grupo de Investigación Hugel, Universidad de Friburgo