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secuenciador de ADN

Un secuenciador de ADN es un instrumento científico que se utiliza para automatizar el proceso de secuenciación del ADN . A partir de una muestra de ADN , un secuenciador de ADN...

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Un secuenciador de ADN es un instrumento científico que se utiliza para automatizar el proceso de secuenciación del ADN . A partir de una muestra de ADN , un secuenciador de ADN determina el orden de las cuatro bases : G ( guanina ), C ( citosina ), A ( adenina ) y T ( timina ). Este resultado se registra como una cadena de texto , denominada lectura. Algunos secuenciadores de ADN también pueden considerarse instrumentos ópticos, ya que analizan las señales luminosas que emiten los fluorocromos unidos a los nucleótidos .

El primer secuenciador automático de ADN, inventado por Lloyd M. Smith , fue presentado por Applied Biosystems en 1987. [ 1 ] Utilizaba el método de secuenciación de Sanger , una tecnología que constituyó la base de la "primera generación" de secuenciadores de ADN [ 2 ] [ 3 ] y permitió la finalización del Proyecto Genoma Humano en 2001. [ 4 ] Esta primera generación de secuenciadores de ADN son esencialmente sistemas de electroforesis automatizados que detectan la migración de fragmentos de ADN marcados. Por lo tanto, estos secuenciadores también pueden utilizarse en la genotipificación de marcadores genéticos donde solo es necesario determinar la longitud de uno o más fragmentos de ADN (por ejemplo, microsatélites , AFLP ).

El Proyecto Genoma Humano impulsó el desarrollo de plataformas más económicas, de alto rendimiento y más precisas, conocidas como secuenciadores de nueva generación (NGS), para secuenciar el genoma humano . Estas incluyen las plataformas de secuenciación de ADN 454, SOLiD e Illumina . Las máquinas de secuenciación de nueva generación han aumentado sustancialmente la velocidad de secuenciación de ADN, en comparación con los métodos Sanger anteriores. Las muestras de ADN se pueden preparar automáticamente en tan solo 90 minutos, [ 5 ] mientras que un genoma humano se puede secuenciar con una cobertura de 15x en cuestión de días. [ 6 ]

Los secuenciadores de ADN más recientes, de tercera generación, como PacBio SMRT y Oxford Nanopore, ofrecen la posibilidad de secuenciar moléculas largas, en comparación con las tecnologías de lectura corta como Illumina SBS o DNBSEQ de MGI Tech.

Debido a las limitaciones de la tecnología de secuenciación de ADN, las lecturas de muchas de estas tecnologías son cortas en comparación con la longitud de un genoma ; por lo tanto, deben ensamblarse en contigs más largos . [ 7 ] Los datos también pueden contener errores, causados ​​por limitaciones en la técnica de secuenciación de ADN o por errores durante la amplificación por PCR . Los fabricantes de secuenciadores de ADN utilizan varios métodos diferentes para detectar qué bases de ADN están presentes. Los protocolos específicos aplicados en las diferentes plataformas de secuenciación tienen un impacto en los datos finales que se generan. Por lo tanto, comparar la calidad de los datos y el costo entre diferentes tecnologías puede ser una tarea desalentadora. Cada fabricante proporciona sus propias formas de informar sobre errores y puntuaciones de secuenciación. Sin embargo, los errores y las puntuaciones entre diferentes plataformas no siempre se pueden comparar directamente. Dado que estos sistemas se basan en diferentes enfoques de secuenciación de ADN, la elección del mejor secuenciador de ADN y método generalmente dependerá de los objetivos del experimento y del presupuesto disponible. [ 2 ]

Historia

Los primeros métodos de secuenciación de ADN fueron desarrollados por Gilbert (1973) [ 8 ] y Sanger (1975). [ 9 ] Gilbert introdujo un método de secuenciación basado en la modificación química del ADN seguida de la escisión en bases específicas, mientras que la técnica de Sanger se basa en la terminación de la cadena con dideoxinucleótidos . El método de Sanger se popularizó debido a su mayor eficiencia y baja radiactividad. El primer secuenciador automático de ADN fue el AB370A, presentado en 1986 por Applied Biosystems . El AB370A era capaz de secuenciar 96 muestras simultáneamente, 500 kilobases por día, y alcanzar longitudes de lectura de hasta 600 bases. Este fue el comienzo de la "primera generación" de secuenciadores de ADN, [ 2 ] [ 3 ] que implementó la secuenciación de Sanger, dideoxinucleótidos fluorescentes y gel de poliacrilamida intercalado entre placas de vidrio (geles en placa). El siguiente gran avance fue el lanzamiento en 1995 del AB310 que utilizaba un polímero lineal en un capilar en lugar del gel de placa para la separación de hebras de ADN por electroforesis. Estas técnicas formaron la base para la finalización del Proyecto Genoma Humano en 2001. [ 4 ] El Proyecto Genoma Humano impulsó el desarrollo de plataformas más baratas, de alto rendimiento y más precisas conocidas como secuenciadores de próxima generación (NGS). En 2005, 454 Life Sciences lanzó el secuenciador 454, seguido por el analizador de genoma Solexa y SOLiD (detección de ligación de oligonucleótidos soportada) por Agencourt en 2006. Applied Biosystems adquirió Agencourt en 2006, y en 2007, Roche compró 454 Life Sciences, mientras que Illumina compró Solexa. Ion Torrent entró en el mercado en 2010 y fue adquirido por Life Technologies (ahora Thermo Fisher Scientific ). Tras adquirir Complete Genomics, empresa perteneciente a MGI , BGI comenzó a fabricar secuenciadores en China . Estos siguen siendo los sistemas NGS más comunes debido a su precio competitivo, precisión y rendimiento.

Más recientemente, se introdujo una tercera generación de secuenciadores de ADN. Los métodos de secuenciación que emplean estos secuenciadores no requieren amplificación de ADN (reacción en cadena de la polimerasa - PCR), lo que acelera la preparación de la muestra antes de la secuenciación y reduce los errores. Además, los datos de secuenciación se obtienen a partir de las reacciones causadas por la adición de nucleótidos en la cadena complementaria en tiempo real. Dos empresas introdujeron enfoques diferentes en sus secuenciadores de tercera generación. Los secuenciadores de Pacific Biosciences utilizan un método denominado SMRT (Single-molecule real-time), donde los datos de secuenciación se generan mediante la luz (capturada por una cámara) emitida cuando se añade un nucleótido a la cadena complementaria mediante enzimas que contienen colorantes fluorescentes. Oxford Nanopore Technologies es otra empresa que desarrolla secuenciadores de tercera generación utilizando sistemas electrónicos basados ​​en tecnologías de detección de nanoporos .

Fabricantes de secuenciadores de ADN

Los secuenciadores de ADN han sido desarrollados, fabricados y comercializados, entre otras, por las siguientes empresas.

Roche

El secuenciador de ADN 454 fue el primer secuenciador de nueva generación en alcanzar el éxito comercial. [ 10 ] Fue desarrollado por 454 Life Sciences y adquirido por Roche en 2007. El 454 utiliza la detección del pirofosfato liberado por la reacción de la ADN polimerasa al añadir un nucleótido a la cepa molde.

Roche fabricó dos sistemas basados ​​en su tecnología de pirosecuenciación: el GS FLX+ y el GS Junior System. [ 11 ] El GS FLX+ System promete longitudes de lectura de aproximadamente 1000 pares de bases, mientras que el GS Junior System promete lecturas de 400 pares de bases. [ 12 ] [ 13 ] Un predecesor del GS FLX+, el sistema 454 GS FLX Titanium se lanzó en 2008, logrando una salida de 0,7 G de datos por ejecución, con una precisión del 99,9 % después del filtro de calidad y una longitud de lectura de hasta 700 pb. En 2009, Roche lanzó el GS Junior, una versión de sobremesa del secuenciador 454 con una longitud de lectura de hasta 400 pb, y preparación de bibliotecas y procesamiento de datos simplificados.

Una de las ventajas de los sistemas 454 es su velocidad de ejecución. Se puede reducir la mano de obra con la automatización de la preparación de bibliotecas y la semiautomatización de la PCR en emulsión. Una desventaja del sistema 454 es que es propenso a errores al estimar el número de bases en una larga cadena de nucleótidos idénticos. Esto se conoce como error de homopolímero y ocurre cuando hay 6 o más bases idénticas en una fila. [ 14 ] Otra desventaja es que el precio de los reactivos es relativamente más caro en comparación con otros secuenciadores de nueva generación.

En 2013, Roche anunció que detendría el desarrollo de la tecnología 454 y que retiraría por completo las máquinas 454 en 2016, cuando su tecnología dejara de ser competitiva. [ 15 ] [ 16 ]

Roche produce una serie de herramientas de software que están optimizadas para el análisis de datos de secuenciación 454. [ 17 ] Tales como,

  • GS Run Processor convierte las imágenes sin procesar generadas por una ejecución de secuenciación en valores de intensidad. [ 18 ] El proceso consta de dos pasos principales: procesamiento de imágenes y procesamiento de señales. El software también aplica normalización, corrección de señales, identificación de bases y puntuaciones de calidad para lecturas individuales. El software genera datos en archivos de formato de flujograma estándar (o SFF) para su uso en aplicaciones de análisis de datos (GS De Novo Assembler, GS Reference Mapper o GS Amplicon Variant Analyzer).
  • GS De Novo Assembler es una herramienta para el ensamblaje de novo de genomas completos de hasta 3 GB a partir de lecturas de secuenciación aleatoria (shotgun reads) solas o combinadas con datos de extremos apareados generados por secuenciadores 454. También admite el ensamblaje de novo de transcritos (incluido el análisis) y la detección de variantes de isoformas . [ 17 ]
  • GS Reference Mapper mapea lecturas cortas a un genoma de referencia , generando una secuencia consenso . El software puede generar archivos de salida para su análisis, indicando inserciones, deleciones y SNP. Puede manejar genomas grandes y complejos de cualquier tamaño. [ 17 ]
  • Finalmente, el analizador de variantes de amplicones GS alinea las lecturas de las muestras de amplicones con una referencia, identificando variantes (ligadas o no) y sus frecuencias. También puede utilizarse para detectar variantes desconocidas y de baja frecuencia. Incluye herramientas gráficas para el análisis de alineaciones. [ 17 ]

Illumina

Máquina de secuenciación Illumina Genome Analyzer II

Illumina produce varias máquinas de secuenciación de próxima generación utilizando tecnología adquirida de Manteia Predictive Medicine y desarrollada por Solexa. [ 19 ] Illumina fabrica varias máquinas de secuenciación de próxima generación que utilizan esta tecnología, incluyendo HiSeq, Genome Analyzer IIx, MiSeq y HiScanSQ, que también puede procesar microarrays . [ 20 ]

La tecnología que dio origen a estos secuenciadores de ADN fue lanzada por primera vez por Solexa en 2006 como el Analizador de Genoma. [ 10 ] Illumina compró Solexa en 2007. El Analizador de Genoma utiliza un método de secuenciación por síntesis. El primer modelo produjo 1G por ejecución. Durante el año 2009, la producción aumentó de 20G por ejecución en agosto a 50G por ejecución en diciembre. En 2010, Illumina lanzó el HiSeq 2000 con una producción de 200 y luego 600G por ejecución que tomaría 8 días. En su lanzamiento, el HiSeq 2000 proporcionó una de las plataformas de secuenciación más económicas a $0.02 por millón de bases según el costo del Instituto de Genómica de Beijing .

En 2011, Illumina lanzó un secuenciador de sobremesa llamado MiSeq. En su lanzamiento, el MiSeq podía generar 1,5 G por corrida con lecturas de extremos apareados de 150 pb. Una corrida de secuenciación puede realizarse en 10 horas cuando se utiliza la preparación automatizada de muestras de ADN. [ 10 ]

El Illumina HiSeq utiliza dos herramientas de software para calcular el número y la posición de los grupos de ADN y así evaluar la calidad de la secuenciación: el sistema de control HiSeq y el analizador en tiempo real. Estos métodos ayudan a determinar si los grupos cercanos interfieren entre sí. [ 10 ]

Tecnologías de la vida

Life Technologies (ahora Thermo Fisher Scientific ) produce secuenciadores de ADN bajo las marcas Applied Biosystems e Ion Torrent . Applied Biosystems fabrica la plataforma de secuenciación de próxima generación SOLiD [ 21 ] y secuenciadores de ADN basados ​​en Sanger, como el analizador genético 3500 [ 22 ] . Bajo la marca Ion Torrent, Applied Biosystems produce cuatro secuenciadores de próxima generación: el sistema Ion PGM, el sistema Ion Proton, el sistema Ion S5 y el sistema Ion S5xl [ 23 ] . Se cree que la empresa también está desarrollando su nuevo secuenciador de ADN capilar llamado SeqStudio, que se lanzará a principios de 2018 [ 24 ].

SOLiD Systems fue adquirida por Applied Biosystems en 2006. SOLiD utiliza secuenciación por ligación y codificación de doble base . El primer sistema SOLiD se lanzó en 2007, generando lecturas de 35 pb y 3 GB de datos por ejecución. Tras cinco actualizaciones, el sistema de secuenciación 5500xl se lanzó en 2010, aumentando considerablemente la longitud de lectura a 85 pb, mejorando la precisión hasta el 99,99 % y produciendo 30 GB por ejecución de 7 días. [ 10 ]

La longitud de lectura limitada del SOLiD sigue siendo una deficiencia importante [ 25 ] y, en cierta medida, ha restringido su uso a experimentos donde la longitud de lectura es menos crucial, como la resecuenciación y el análisis del transcriptoma , y ​​más recientemente, los experimentos de ChIP-Seq y metilación. [ 10 ] El tiempo de preparación de muestras de ADN para los sistemas SOLiD se ha reducido considerablemente gracias a la automatización de la preparación de bibliotecas de secuenciación, como el sistema Tecan. [ 10 ]

Los datos del espacio de color generados por la plataforma SOLiD pueden decodificarse en bases de ADN para su posterior análisis; sin embargo, el software que considera la información original del espacio de color puede proporcionar resultados más precisos. Life Technologies ha lanzado BioScope, [ 26 ] un paquete de análisis de datos para resecuenciación, ChiP-Seq y análisis de transcriptoma. Utiliza el algoritmo MaxMapper para mapear las lecturas del espacio de color.

Beckman Coulter

Beckman Coulter (ahora Danaher ) ha fabricado previamente secuenciadores de ADN basados ​​en electroforesis capilar y terminación de cadena bajo el nombre de modelo CEQ, incluido el CEQ 8000. [ 27 ] La empresa ahora produce el sistema de análisis genético GeXP, que utiliza secuenciación con terminadores de tinte . [ 28 ] Este método utiliza un termociclador de forma muy similar a la PCR para desnaturalizar, hibridar y extender fragmentos de ADN, amplificando los fragmentos secuenciados. [ 29 ] [ 30 ]

Biociencias del Pacífico

Pacific Biosciences produce los sistemas de secuenciación PacBio RS y Sequel utilizando un método de secuenciación en tiempo real de molécula única , o SMRT. [ 31 ] Este sistema puede producir longitudes de lectura de varios miles de pares de bases. Los errores de lectura bruta más altos se corrigen utilizando consenso circular, donde la misma hebra se lee una y otra vez, o utilizando estrategias de ensamblaje optimizadas . [ 32 ] Los científicos han reportado una precisión del 99,9999% con estas estrategias. [ 33 ] El sistema Sequel se lanzó en 2015 con una mayor capacidad y un precio más bajo. [ 34 ] [ 35 ]

El secuenciador Oxford Nanopore MinION (abajo a la derecha) se utilizó en la primera secuenciación de ADN en el espacio en agosto de 2016 por la astronauta Kathleen Rubins . [ 36 ]

Nanoporo de Oxford

El secuenciador MinION de Oxford Nanopore Technologies se basa en la evolución de la tecnología de secuenciación de nanoporos para análisis de ácidos nucleicos . [ 37 ] El dispositivo mide cuatro pulgadas de largo y se alimenta mediante un puerto USB . MinION decodifica el ADN directamente a medida que la molécula se extrae a una velocidad de 450 bases/segundo a través de un nanoporo suspendido en una membrana. [ 38 ] Los cambios en la corriente eléctrica indican qué base está presente. Inicialmente, el dispositivo tenía una precisión del 60 al 85 por ciento, en comparación con el 99,9 por ciento de las máquinas convencionales. [ 39 ] Incluso los resultados inexactos pueden resultar útiles porque produce longitudes de lectura largas. [ 40 ] A principios de 2021, investigadores de la Universidad de Columbia Británica utilizaron etiquetas moleculares especiales y lograron reducir la tasa de error del cinco al 15 por ciento del dispositivo a menos del 0,005 por ciento, incluso al secuenciar muchos tramos largos de ADN a la vez. [ 41 ] Hay dos iteraciones de productos más basadas en MinION; El primero es el GridION, un secuenciador ligeramente más grande que procesa hasta cinco celdas de flujo MinION a la vez. El segundo es el PromethION, que utiliza hasta 100 000 poros en paralelo, más adecuado para la secuenciación de alto volumen. [ 42 ]

MGI

MGI produce secuenciadores de alto rendimiento para investigación científica y aplicaciones clínicas como DNBSEQ-G50, DNBSEQ-G400 y DNBSEQ-T7, bajo una tecnología DNBSEQ patentada. [ 43 ] Se basa en tecnologías de secuenciación de nanobolas de ADN y síntesis de anclaje de sonda combinatoria, en las que las nanobolas de ADN (DNB) se cargan en un chip de matriz con patrón a través del sistema fluidico, y luego se agrega un cebador de secuenciación a la región adaptadora de las DNB para la hibridación . DNBSEQ-T7 puede generar lecturas cortas a una escala muy grande, hasta 60 genomas humanos por día. [ 44 ] DNBSEQ-T7 se utilizó para generar lecturas de extremos emparejados de 150 pb, secuenciando 30X, para secuenciar el genoma del SARS-CoV-2 o COVID-19 para identificar la predisposición de variantes genéticas en la enfermedad grave de COVID-19. [ 45 ] Utilizando una técnica novedosa, los investigadores del Banco Nacional de Genes de China secuenciaron bibliotecas sin PCR en los microarrays DNBSEQ sin PCR de MGI para obtener por primera vez una secuenciación de genoma completo verdaderamente sin PCR . [ 46 ] MGISEQ-2000 se utilizó en la secuenciación de ARN de células individuales para estudiar la patogénesis subyacente y la recuperación en pacientes con COVID-19, como se publicó en Nature Medicine . [ 47 ]

Comparación

La oferta actual en tecnología de secuenciación de ADN muestra un actor dominante: Illumina (diciembre de 2019), seguido de PacBio , MGI y Oxford Nanopore .

Referencias

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