Secuenciación sólida ABI

SOLiD (Secuenciación por Ligación y Detección de Oligonucleótidos) es una tecnología de secuenciación de ADN de última generación desarrollada por Life Technologies y disponible comercialmente desde 2006. Esta tecnología genera entre 10⁸ ^y 10⁹ ^lecturas de secuencias pequeñas a la vez. Utiliza codificación de 2 bases para decodificar los datos brutos generados por la plataforma de secuenciación y convertirlos en datos de secuencia.

Este método no debe confundirse con la "secuenciación por síntesis", un principio utilizado por la pirosecuenciación Roche-454 (introducida en 2005, que generó millones de lecturas de 200-400 pb en 2009) y el sistema Solexa (ahora propiedad de Illumina) (introducido en 2006, que generó cientos de millones de lecturas de 50-100 pb en 2009).

Estos métodos han reducido el costo de $0.01/base en 2004 a casi $0.0001/base en 2006 y aumentaron la capacidad de secuenciación de 1,000,000 bases/máquina/día en 2004 a más de 5,000,000,000 bases/máquina/día en 2009. Existen más de 30 publicaciones que describen su uso primero para el posicionamiento de nucleosomas por Valouev et al., ^{[ 1 ]} perfilado transcripcional o RNA-Seq sensible a la cadena con Cloonan et al., ^{[ 2 ]} perfilado transcripcional de células individuales con Tang et al. ^{[ 3 ]} y finalmente resecuenciación humana con McKernan et al. ^{[ 4 ]}

Se ha informado que el método utilizado por esta máquina (secuenciación por ligación) tiene algunos problemas para secuenciar secuencias palindrómicas. ^{[ 5 ]}

Se prepara una biblioteca de fragmentos de ADN a partir de la muestra que se va a secuenciar, la cual se utiliza para preparar poblaciones de microesferas clonales. Es decir, solo una especie de fragmento estará presente en la superficie de cada microesfera magnética. Los fragmentos unidos a las microesferas magnéticas tendrán una secuencia adaptadora P1 universal, de modo que la secuencia inicial de cada fragmento sea conocida e idéntica. La PCR en emulsión se lleva a cabo en microrreactores que contienen todos los reactivos necesarios para la PCR. Las microesferas con los productos de PCR resultantes se depositan en un portaobjetos de vidrio.

Los cebadores se hibridan con la secuencia adaptadora P1 dentro de la plantilla de la biblioteca. Un conjunto de cuatro sondas de dos bases marcadas con fluorescencia compiten por la ligación al cebador de secuenciación. La especificidad de la sonda de dos bases se logra interrogando cada primera y segunda base en cada reacción de ligación. Se realizan múltiples ciclos de ligación, detección y escisión, y el número de ciclos determina la longitud de lectura final. Tras una serie de ciclos de ligación, se elimina el producto de extensión y la plantilla se reinicia con un cebador complementario a la posición n-1 para una segunda ronda de ciclos de ligación.

Se realizan cinco rondas de reinicio de cebadores para cada etiqueta de secuencia. Mediante este proceso, cada base se analiza en dos reacciones de ligación independientes con dos cebadores diferentes. Por ejemplo, la base en la posición de lectura 5 se analiza con el cebador número 2 en el ciclo de ligación 2 y con el cebador número 3 en el ciclo de ligación 1.

Según ABI, la plataforma SOLiD 3plus genera 60 gigabases de datos de ADN utilizables por análisis. Gracias a su sistema de codificación de dos bases, la tecnología incorpora una verificación de precisión inherente que ofrece una exactitud del 99,94 %. La química del sistema también implica que no se ve afectada por los homopolímeros, a diferencia del sistema Roche 454 FLX, por lo que las regiones repetitivas de homopolímeros, grandes y complejas, ya no representan un problema para la secuenciación.

Naturalmente, esta tecnología se utilizará para secuenciar ADN, pero debido a la alta capacidad de procesamiento paralelo de todas las tecnologías de nueva generación, también tienen aplicaciones en transcriptómica y epigenómica .

Los microarrays fueron la base de la transcriptómica durante los últimos diez años, y la tecnología basada en microarrays se ha extendido a otras áreas. Sin embargo, presentan limitaciones, ya que solo se puede obtener información sobre las sondas presentes en el chip. Solo se puede obtener información sobre organismos para los que existen chips disponibles, y conllevan todos los problemas que implica la hibridación de un gran número de moléculas (debido a las diferentes temperaturas de hibridación). La transcriptómica RNA-Seq mediante secuenciación de nueva generación eliminará estas limitaciones. El transcriptoma completo de cualquier organismo podría secuenciarse potencialmente en una sola ejecución (para genomas bacterianos muy pequeños), y no solo se podría identificar cada transcrito, sino que también sería posible realizar perfiles de expresión, ya que se podrían obtener lecturas cuantitativas.

La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método para determinar los sitios de unión de factores de transcripción y las interacciones ADN-proteína. Anteriormente, se había combinado con la tecnología de microarrays (ChIP-chip) con cierto éxito. La secuenciación de nueva generación también puede aplicarse en este campo. Asimismo, se puede realizar la inmunoprecipitación de metilación (MeDIP), también en microarrays.

La capacidad de obtener más información sobre la metilación y los sitios de unión de los factores de transcripción a escala genómica es un recurso valioso que podría enseñarnos mucho sobre las enfermedades y la biología molecular en general.

• 2 Codificación base
• Secuenciación de próxima generación
• Biosistemas Aplicados
• Illumina (empresa)
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• Mardis ER (2008). "Métodos de secuenciación de ADN de próxima generación". Annual Review of Genomics and Human Genetics . 9 : 387–402 . doi : 10.1146/annurev.genom.9.081307.164359 . PMID 18576944 . 
• Mardis ER (2009). " Nuevas estrategias y tecnologías emergentes para la secuenciación masivamente paralela: aplicaciones en la investigación médica" . Genome Medicine . 1 (4): 40. doi : 10.1186/gm40 . PMC 2684661. PMID 19435481 .