RecBCD

La exodesoxirribonucleasa V (EC 3.1.11.5, RecBCD, Exonucleasa V, exonucleasa V de Escherichia coli , exonucleasa V de E. coli , gen recBC endoenzima, RecBC desoxirribonucleasa, gen recBC DNase, gen recBC enzimas ) es una enzima de E. coli que inicia la reparación recombinatoria de roturas de doble cadena potencialmente letales en el ADN que pueden resultar de la radiación ionizante , errores de replicación, endonucleasas , daño oxidativo y una serie de otros factores. ^{[2] [3]} La enzima RecBCD es a la vez una helicasa que desenrolla o separa las cadenas de ADN y una nucleasa que hace mellas monocatenarias en el ADN. ^[1] Cataliza la escisión exonucleolítica (en presencia de ATP) en dirección 5′ a 3′ o 3′ a 5′ para producir 5′-fosfooligonucleótidos.

El complejo enzimático está compuesto por tres subunidades diferentes llamadas RecB, RecC y RecD, por lo que el complejo se denomina RecBCD (Figura 1). Antes del descubrimiento del gen recD , ^[4] la enzima se conocía como “RecBC”. Cada subunidad está codificada por un gen diferente:

Tanto la subunidad RecD como la subunidad RecB son helicasas, es decir , motores moleculares dependientes de energía que desenrollan el ADN (o el ARN en el caso de otras proteínas). La subunidad RecB además tiene una función de nucleasa. ^[5] Finalmente, la enzima RecBCD (quizás la subunidad RecC) reconoce una secuencia específica en el ADN, 5' -GCTGGTGG- 3' , conocida como Chi (a veces designada con la letra griega χ).

RecBCD es inusual entre las helicasas porque tiene dos helicasas que viajan a diferentes velocidades ^[6] y porque puede reconocer y ser alterada por la secuencia de ADN Chi. ^{[7] [8]} RecBCD se une ávidamente a un extremo de ADN bicatenario lineal (ds). La helicasa RecD viaja en la hebra con un extremo 5' en el que la enzima inicia el desenrollado, y RecB en la hebra con un extremo 3'. RecB es más lento que RecD, de modo que un bucle de ADN monocatenario (ss) se acumula antes que RecB (Figura 2). Esto produce estructuras de ADN con dos colas ss (una cola más corta con un extremo 3' y una cola más larga con un extremo 5') y un bucle ss (en la hebra con un extremo 3') observados por microscopía electrónica. ^[9] Las colas ss pueden recocerse para producir un segundo bucle ss complementario al primero; estas estructuras de bucle doble se denominaron inicialmente "orejas de conejo".

Durante el desenrollado, la nucleasa en RecB puede actuar de diferentes maneras dependiendo de las condiciones de reacción, en particular la relación de las concentraciones de iones Mg ²⁺ y ATP. (1) Si el ATP está en exceso, la enzima simplemente corta la hebra con Chi (la hebra con el extremo 3' inicial) (Figura 2). ^{[10] [11]} El desenrollado continúa y produce una cola 3' ss con Chi cerca de su extremo. Esta cola puede ser unida por la proteína RecA, que promueve el intercambio de hebra con un dúplex de ADN homólogo intacto. ^[12] Cuando RecBCD llega al final del ADN, las tres subunidades se desensamblan y la enzima permanece inactiva durante una hora o más; ^[13] una molécula de RecBCD que actuó en Chi no ataca a otra molécula de ADN. (2) Si hay un exceso de iones Mg ^{2+ , RecBCD escinde ambas cadenas de ADN endonucleolíticamente, aunque la cola 5' se escinde con menos frecuencia (Figura 3). [14]} Cuando RecBCD encuentra un sitio Chi en la cadena con terminación 3', el desenrollado se detiene y se reduce la digestión de la cola 3'. ^[15] Cuando RecBCD reanuda el desenrollado, ahora escinde la cadena opuesta ( es decir , la cola 5') ^{[16] [17]} y carga la proteína RecA en la cadena con terminación 3'. ^[12] Después de completar la reacción en una molécula de ADN, la enzima ataca rápidamente un segundo ADN, en el que ocurren las mismas reacciones que en el primer ADN.

Aunque ninguna reacción ha sido verificada por análisis de ADN intracelular, debido a la naturaleza transitoria de los intermediarios de reacción, la evidencia genética indica que la primera reacción imita más de cerca a la que ocurre en las células. ^[2] Por ejemplo, la actividad de Chi está influenciada por nucleótidos en su lado 3', tanto en células como en reacciones con ATP en exceso pero no con Mg ²⁺ en exceso [PMIDs 27401752, 27330137]. Los mutantes RecBCD que carecen de actividad exonucleasa detectable mantienen una alta actividad de punto caliente de Chi en las células y hacen mella en Chi fuera de las células. ^[18] Un sitio Chi en una molécula de ADN en las células reduce o elimina la actividad Chi en otro ADN, tal vez reflejando el desmontaje dependiente de Chi de RecBCD observado in vitro en condiciones de exceso de ATP y mella de ADN en Chi. ^{[19] [20]}

En ambas condiciones de reacción, la cadena 3' permanece intacta aguas abajo de Chi. Luego, RecBCD carga activamente la proteína RecA en la cola 3'. ^[12] En algún punto indeterminado, RecBCD se disocia del ADN, aunque RecBCD puede desenrollar al menos 60 kb de ADN sin desprenderse. RecA inicia el intercambio de la cadena de ADN a la que está unida con la cadena idéntica, o casi idéntica, en un dúplex de ADN intacto; este intercambio de cadenas genera una molécula de ADN conjunta, como un bucle D (Figura 2). Se cree que la molécula de ADN conjunta se resuelve ya sea por replicación cebada por la cadena invasora con extremo 3' que contiene Chi o por escisión del bucle D y formación de una unión de Holliday. La unión de Holliday puede resolverse en ADN lineal por el complejo RuvABC o disociarse por la proteína RecG. Cada uno de estos eventos puede generar ADN intacto con nuevas combinaciones de marcadores genéticos por los cuales los ADN parentales pueden diferir. Este proceso, la recombinación homóloga , completa la reparación de la rotura de la doble cadena del ADN.

Las enzimas RecD se dividen en dos grupos RecD1 (conocido como RecD) y RecD2. ^[21] Muchos organismos tienen un gen recD aunque los otros miembros de un complejo recBCD, es decir, rec B y recC, no estén presentes. ^[22] Por ejemplo, la bacteria Deinococcus radiodurans , que tiene una capacidad extraordinaria de reparación del ADN , es un ejemplo de un organismo que no posee un gen recB o recC , y sin embargo tiene un gen recD . ^[22] En la bacteria Escherichia coli , la proteína RecD es parte del complejo RecBCD bien estudiado que es necesario para la reparación del ADN recombinacional (como se describió anteriormente). En la bacteria Bacillus subtilis , la proteína RecD2 tiene un papel como modulador del reinicio de la replicación y también como modulador de la recombinasa RecA . ^[21] RecD2 puede inhibir eventos de recombinación no deseados cuando las horquillas de replicación están estancadas, y también puede tener un papel en el desplazamiento de la proteína RecA de los intermediarios de recombinación para permitir el avance de la horquilla de replicación. ^[21]

RecBCD es una enzima modelo para el uso de fluorescencia de moléculas individuales como una técnica experimental utilizada para comprender mejor la función de las interacciones proteína-ADN. ^[23] La enzima también es útil para eliminar ADN lineal, ya sea monocatenario o bicatenario, de preparaciones de ADN bicatenario circular, ya que requiere un extremo de ADN para la actividad.

• Exodesoxirribonucleasa+V en los encabezados de materias médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
• Exodesoxirribonucleasa+V,+E+coli en los encabezados de materias médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
• CE 3.1.11.5