microarrays de proteínas

Un microarreglo de proteínas (o chip de proteínas ) es un método de alto rendimiento utilizado para rastrear las interacciones y actividades de las proteínas, y para determinar su función, y determinar la función a gran escala. ^{[ 1 ]} Su principal ventaja radica en el hecho de que se puede rastrear un gran número de proteínas en paralelo. El chip consta de una superficie de soporte como un portaobjetos de vidrio, una membrana de nitrocelulosa, una microesfera o una placa de microtitulación , a la que se une un arreglo de proteínas de captura. ^{[ 2 ]} Se añaden al arreglo moléculas sonda , generalmente marcadas con un colorante fluorescente. Cualquier reacción entre la sonda y la proteína inmovilizada emite una señal fluorescente que es leída por un escáner láser . ^{[ 3 ]} Los microarreglos de proteínas son rápidos, automatizados, económicos y altamente sensibles, consumiendo pequeñas cantidades de muestras y reactivos. ^{[ 4 ]} El concepto y la metodología de los microarreglos de proteínas se introdujeron e ilustraron por primera vez en los microarreglos de anticuerpos (también denominados matriz de anticuerpos ) en 1983 en una publicación científica ^{[ 5 ]} y una serie de patentes. ^{[ 6 ]} La tecnología de alto rendimiento detrás del microarreglo de proteínas fue relativamente fácil de desarrollar ya que se basa en la tecnología desarrollada para los microarreglos de ADN , ^{[ 7 ]} que se han convertido en los microarreglos más utilizados .

Los microarrays de proteínas se desarrollaron debido a las limitaciones del uso de microarrays de ADN para determinar los niveles de expresión génica en proteómica . La cantidad de ARNm en la célula a menudo no refleja los niveles de expresión de las proteínas a las que corresponde. Dado que generalmente es la proteína, y no el ARNm, la que tiene el papel funcional en la respuesta celular, se necesitaba un enfoque novedoso. Además, las modificaciones postraduccionales , que a menudo son críticas para determinar la función de la proteína, no son visibles en los microarrays de ADN. ^{[ 8 ]} Los microarrays de proteínas reemplazan las técnicas proteómicas tradicionales como la electroforesis en gel 2D o la cromatografía , que eran lentas, laboriosas e inadecuadas para el análisis de proteínas de baja abundancia.

Las proteínas se disponen sobre una superficie sólida, como portaobjetos, membranas, microesferas o placas de microtitulación. Esta superficie sirve de soporte para la inmovilización de las proteínas, demostrando propiedades de unión óptimas y manteniendo la proteína en su conformación nativa para preservar su capacidad de unión. Los portaobjetos de vidrio o silicio son una opción popular, ya que son compatibles con los sistemas robóticos de microarrays y escáneres láser, fácilmente disponibles y desarrollados para la tecnología de microarrays de ADN. Los portaobjetos de película de nitrocelulosa se consideran el sustrato con mayor capacidad de unión a proteínas para aplicaciones de microarrays.

La superficie sólida elegida se recubre con una capa que debe cumplir simultáneamente las funciones de inmovilizar la proteína, prevenir su desnaturalización , orientarla en la dirección adecuada para que sus sitios de unión sean accesibles y proporcionar un entorno hidrofílico en el que pueda tener lugar la reacción de unión. También debe presentar una unión inespecífica mínima para minimizar el ruido de fondo en los sistemas de detección. Además, debe ser compatible con diferentes sistemas de detección. Los agentes inmovilizadores incluyen capas de aluminio u oro, polímeros hidrofílicos y geles de poliacrilamida , o tratamiento con aminas , aldehído o epoxi . Se emplean tecnologías de película delgada como la deposición física de vapor (PVD) y la deposición química de vapor (CVD) para aplicar el recubrimiento a la superficie del soporte.

Un entorno acuoso es esencial en todas las etapas de la fabricación y el funcionamiento de los microarrays para prevenir la desnaturalización de las proteínas. Por lo tanto, los tampones de muestra contienen un alto porcentaje de glicerol (para reducir el punto de congelación) y la humedad del entorno de fabricación se regula cuidadosamente. Los micropocillos ofrecen la doble ventaja de proporcionar un entorno acuoso y, al mismo tiempo, prevenir la contaminación cruzada entre muestras.

En el tipo más común de matriz de proteínas, los robots colocan grandes cantidades de proteínas o sus ligandos sobre un soporte sólido recubierto siguiendo un patrón predefinido. Esto se conoce como impresión por contacto robótica o deposición robótica. Otro método de fabricación es la inyección de tinta , un método sin contacto y de gota a gota para dispersar los polímeros de proteínas sobre la superficie sólida con el patrón deseado. ^{[ 9 ]} La deposición piezoeléctrica es un método similar a la impresión por inyección de tinta. El cabezal de impresión se mueve a través de la matriz y, en cada punto, utiliza estimulación eléctrica para depositar las moléculas de proteína sobre la superficie mediante pequeños chorros. Este también es un proceso sin contacto. ^{[ 10 ]} La fotolitografía es un cuarto método para organizar las proteínas en la superficie. Se utiliza luz junto con fotomáscaras , placas opacas con orificios o transparencias que permiten el paso de la luz siguiendo un patrón definido. Posteriormente, una serie de tratamientos químicos permite la deposición de la proteína con el patrón deseado sobre el material situado debajo de la fotomáscara. ^{[ 11 ]}

Las moléculas de captura dispuestas en la superficie sólida pueden ser anticuerpos , antígenos , aptámeros (ligandos basados ​​en ácidos nucleicos), afibodies (moléculas pequeñas diseñadas para imitar anticuerpos monoclonales) o proteínas completas. Las fuentes de dichas proteínas incluyen sistemas de expresión celular para proteínas recombinantes , purificación a partir de fuentes naturales, producción in vitro mediante sistemas de traducción libres de células y métodos sintéticos para péptidos . Muchos de estos métodos pueden automatizarse para la producción a gran escala, pero se debe tener cuidado para evitar condiciones de síntesis o extracción que den como resultado una proteína desnaturalizada que, al no reconocer ya a su ligando, inutiliza la matriz.

Las proteínas son altamente sensibles a los cambios en su microambiente. Esto representa un desafío para mantener los conjuntos de proteínas en condiciones estables durante períodos prolongados. Los métodos in situ —inventados y publicados por Mingyue He y Michael Taussig en 2001 ^{[ 12 ] [ 13 ]} — implican la síntesis de proteínas en el chip según sea necesario, directamente a partir del ADN utilizando sistemas de expresión de proteínas libres de células. Dado que el ADN es una molécula altamente estable, no se deteriora con el tiempo y, por lo tanto, es adecuado para el almacenamiento a largo plazo. Este enfoque también es ventajoso porque evita los procesos laboriosos y a menudo costosos de purificación de proteínas y clonación de ADN por separado , ya que las proteínas se fabrican e inmovilizan simultáneamente en un solo paso en la superficie del chip. Ejemplos de técnicas in situ son PISA (conjunto de proteínas in situ), NAPPA ( conjunto de proteínas programable con ácidos nucleicos ) y DAPA (conjunto de ADN a conjunto de proteínas).

Actualmente se utilizan tres tipos de microarrays de proteínas para estudiar las actividades bioquímicas de las proteínas.

Los microarrays analíticos también se conocen como matrices de captura. En esta técnica, una biblioteca de anticuerpos, aptámeros o afibodies se dispone en una matriz sobre la superficie de soporte. Estos se utilizan como moléculas de captura, ya que cada una se une específicamente a una proteína en particular. La matriz se analiza con una solución proteica compleja, como un lisado celular . El análisis de las reacciones de unión resultantes mediante diversos sistemas de detección puede proporcionar información sobre los niveles de expresión de proteínas específicas en la muestra, así como mediciones de afinidades y especificidades de unión. Este tipo de microarray es especialmente útil para comparar la expresión de proteínas en diferentes soluciones. Por ejemplo, la respuesta de las células a un factor particular puede identificarse comparando los lisados ​​de células tratadas con sustancias específicas o cultivadas en determinadas condiciones con los lisados ​​de células de control. Otra aplicación es la identificación y caracterización de tejidos enfermos.

Los microarrays de proteínas de fase inversa (RPPA) utilizan muestras complejas, como lisados ​​de tejido. Se aíslan células de diversos tejidos de interés y se lisan. El lisado se deposita en el microarray y se analiza con anticuerpos dirigidos contra la proteína diana. Estos anticuerpos se detectan típicamente mediante ensayos quimioluminiscentes , fluorescentes o colorimétricos . Se imprimen péptidos de referencia en las láminas para permitir la cuantificación de proteínas en los lisados ​​de las muestras. Los RPA permiten determinar la presencia de proteínas alteradas u otros agentes que pueden ser consecuencia de una enfermedad. En concreto, las modificaciones postraduccionales, que suelen alterarse como resultado de una enfermedad, pueden detectarse mediante RPA. ^{[ 14 ]}

Los microarrays de proteínas funcionales (también conocidos como arrays de proteínas objetivo) se construyen inmovilizando un gran número de proteínas purificadas y se utilizan para identificar interacciones proteína-proteína, proteína-ADN, proteína- ARN , proteína- fosfolípido y proteína-molécula pequeña, para analizar la actividad enzimática y para detectar anticuerpos y demostrar su especificidad. Se diferencian de los arrays analíticos en que los arrays de proteínas funcionales están compuestos por arrays que contienen proteínas funcionales completas o dominios proteicos. Estos chips de proteínas se utilizan para estudiar las actividades bioquímicas de todo el proteoma en un único experimento.

El elemento clave en cualquier ensayo funcional basado en microarrays de proteínas es que las proteínas inmovilizadas deben conservar su estructura nativa, de modo que puedan producirse interacciones funcionales significativas en la superficie del microarray. Las ventajas de controlar el modo preciso de unión a la superficie mediante el uso de una etiqueta de afinidad adecuada son que las proteínas inmovilizadas tendrán una orientación homogénea, lo que resulta en una mayor actividad específica y una mayor relación señal-ruido en los ensayos, con menor interferencia de interacciones no específicas. ^{[ 15 ] [ 16 ]}

Los métodos de detección de matrices de proteínas deben proporcionar una señal alta y un fondo bajo. El método más común y ampliamente utilizado para la detección es el marcaje por fluorescencia, que es altamente sensible, seguro y compatible con los escáneres láser de micromatrices disponibles. Se pueden utilizar otros marcadores, como marcadores de afinidad, fotoquímicos o radioisótopos. Estos marcadores se unen a la propia sonda y pueden interferir con la reacción entre la sonda y la proteína diana. Por lo tanto, existen varios métodos de detección sin marcaje, como la resonancia de plasmones superficiales (SPR), los nanotubos de carbono, los sensores de nanocables de carbono (donde la detección se produce mediante cambios en la conductancia) y los voladizos de sistemas microelectromecánicos (MEMS). ^{[ 17 ]} Todos estos métodos de detección sin marcaje son relativamente nuevos y aún no son adecuados para la detección de interacciones proteicas de alto rendimiento; sin embargo, ofrecen grandes perspectivas para el futuro. Los inmunoensayos en andamios de micropilares de "papel sintético" tiol-eno han demostrado generar una señal de fluorescencia superior. ^{[ 18 ]}

La cuantificación de proteínas en portaobjetos de vidrio recubiertos con nitrocelulosa puede utilizar detección por fluorescencia en el infrarrojo cercano. Esto limita las interferencias debidas a la autofluorescencia de la nitrocelulosa en las longitudes de onda UV utilizadas para las sondas de detección por fluorescencia estándar. ^{[ 19 ]}

Existen cinco áreas principales en las que se aplican los microarrays de proteínas: diagnóstico, proteómica, análisis funcional de proteínas, caracterización de anticuerpos y desarrollo de tratamientos.

El diagnóstico implica la detección de antígenos y anticuerpos en muestras de sangre; el análisis de sueros para descubrir nuevos biomarcadores de enfermedades ; el seguimiento de estados patológicos y respuestas a la terapia en medicina personalizada; y el monitoreo del medio ambiente y los alimentos. El bioensayo digital es un ejemplo del uso de microarrays de proteínas con fines diagnósticos. En esta tecnología, una matriz de micropocillos en un chip de vidrio/polímero se siembra con microesferas magnéticas (recubiertas con anticuerpos marcados con fluorescencia), se somete a antígenos específicos y luego se caracteriza mediante un microscopio contando los pocillos fluorescentes. Recientemente se ha demostrado una plataforma de fabricación rentable (utilizando polímeros OSTE ) para dichas matrices de micropocillos y se ha caracterizado con éxito el sistema modelo de bioensayo. ^{[ 20 ]}

La proteómica se refiere al análisis del perfil de expresión de proteínas, es decir, qué proteínas se expresan en el lisado de una célula en particular.

El análisis funcional de proteínas consiste en la identificación de interacciones proteína-proteína (por ejemplo, la identificación de miembros de un complejo proteico), interacciones proteína-fosfolípido, dianas de moléculas pequeñas, sustratos enzimáticos (en particular, los sustratos de las quinasas ) y ligandos de receptores.

La caracterización de anticuerpos consiste en caracterizar la reactividad cruzada , la especificidad y mapear los epítopos .

Los microarrays también se pueden utilizar para detectar autoanticuerpos, empleando matrices de autoantígenos para analizar en paralelo muchos antígenos o antígenos potenciales. ^{[ 21 ] [ 22 ] [ 23 ]}

El desarrollo de tratamientos implica el desarrollo de terapias antígeno-específicas para enfermedades autoinmunes , cáncer y alergias; la identificación de dianas de moléculas pequeñas que podrían utilizarse como nuevos fármacos.

A pesar de las considerables inversiones realizadas por varias empresas, los chips de proteínas aún no han inundado el mercado. Los fabricantes han descubierto que las proteínas son, en realidad, bastante difíciles de manipular. La producción de proteínas fiables, consistentes y de alto rendimiento, correctamente plegadas y funcionales, está plagada de dificultades, ya que a menudo resultan en un bajo rendimiento debido a la disminución de la solubilidad y la formación de cuerpos de inclusión. Un chip de proteínas requiere muchos más pasos en su creación que un chip de ADN .

Existen varios enfoques para abordar este problema, los cuales difieren fundamentalmente según si las proteínas se inmovilizan mediante interacciones no específicas y mal definidas, o mediante un conjunto específico de interacciones conocidas. El primer enfoque resulta atractivo por su simplicidad y es compatible con proteínas purificadas derivadas de fuentes nativas o recombinantes ^{[ 24 ] [ 25 ]} , pero conlleva varios riesgos. Los más notables se relacionan con la naturaleza incontrolada de las interacciones entre cada proteína y la superficie; en el mejor de los casos, esto podría dar lugar a una población heterogénea de proteínas en la que los sitios activos a veces quedan ocluidos por la superficie; en el peor de los casos, podría destruir la actividad por completo debido al despliegue parcial o total de la proteína inmovilizada mediado por la superficie.

Los desafíos incluyen: 1) encontrar una superficie y un método de unión que permita a las proteínas mantener su estructura secundaria o terciaria y, por lo tanto, su actividad biológica y sus interacciones con otras moléculas; 2) producir una matriz con una larga vida útil para que las proteínas en el chip no se desnaturalicen en un corto tiempo; 3) identificar y aislar anticuerpos u otras moléculas de captura contra cada proteína del genoma humano; 4) cuantificar los niveles de proteína unida asegurando la sensibilidad y evitando el ruido de fondo; 5) extraer la proteína detectada del chip para analizarla posteriormente; 6) reducir la unión no específica por los agentes de captura; 7) la capacidad del chip debe ser suficiente para permitir la visualización de una representación lo más completa posible del proteoma; las proteínas abundantes dificultan la detección de proteínas menos abundantes, como las moléculas de señalización y los receptores, que generalmente son de mayor interés terapéutico. ^{[ 26 ]}

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