Matriz de proteínas sin células

En el método in situ , la síntesis de proteínas se lleva a cabo sobre una superficie de matriz proteica previamente recubierta con un reactivo o anticuerpo de captura de proteínas . Una vez que las proteínas recién sintetizadas se liberan del ribosoma , la secuencia de marcaje , también sintetizada en el extremo N o C de cada proteína naciente, se une al reactivo o anticuerpo de captura, inmovilizando así las proteínas para formar una matriz. Entre los marcadores más utilizados se encuentran la polihistidina (His)6 y la glutatión S-transferasa (GST).

Diversos grupos de investigación han desarrollado sus propios métodos, cada uno con un enfoque diferente, pero que pueden resumirse en 3 grupos principales.

Matriz de proteínas programable de ácido nucleico (NAPPA)

NAPPA ^{[ 4 ]} utiliza una plantilla de ADN que ya ha sido inmovilizada en la misma superficie de captura de proteínas. La plantilla de ADN está biotinilada y unida a avidina que está previamente recubierta en la superficie de captura de proteínas. Las proteínas recién sintetizadas, marcadas con GST, se inmovilizan junto al ADN plantilla mediante la unión al anticuerpo de captura policlonal anti-GST adyacente, que también está previamente recubierto en la superficie de captura. El principal inconveniente de este método son los pasos de preparación adicionales y tediosos al inicio del proceso: (1) la clonación de ADNc en un vector listo para la expresión ; y (2) la necesidad de biotinilar el ADN plasmídico sin interferir con la transcripción. Además, la matriz de proteínas resultante no es "pura" porque las proteínas están colocalizadas con sus plantillas de ADN y anticuerpos de captura. ^{[ 3 ]}

Matriz de proteínas in situ (PISA)

A diferencia de NAPPA, PISA ^{[ 5 ]} evita por completo la inmovilización del ADN, ya que la plantilla de ADN se agrega como una molécula libre en la mezcla de reacción. En 2006, otro grupo refinó y miniaturizó este método utilizando una técnica de múltiples puntos para depositar la plantilla de ADN y la mezcla de transcripción y traducción libre de células en una micromatriz de proteínas de alta densidad con hasta 13 000 puntos. ^{[ 6 ]} Esto fue posible gracias al sistema automatizado utilizado para suministrar de forma precisa y secuencial los reactivos para la reacción de transcripción/traducción que ocurre en una pequeña gota de subnanolitro.

Los formatos de matriz de nanopozos se utilizan para expresar proteínas individuales en recipientes de reacción de pequeño volumen o nanopozos ^{[ 8 ] [ 9 ]} (Figura 4). Este formato a veces se prefiere porque evita la necesidad de inmovilizar la proteína objetivo, lo que podría resultar en la posible pérdida de actividad proteica. La miniaturización de la matriz también conserva la solución y los compuestos valiosos que podrían usarse en ensayos de cribado. Además, las propiedades estructurales de los pocillos individuales ayudan a prevenir la contaminación cruzada entre las cámaras. En 2012 se publicó una versión mejorada de NAPPA, que utilizaba una matriz de nanopozos para prevenir la difusión. En este caso, el ADN se inmovilizó en el pocillo junto con un anticuerpo anti-GST. Luego se añadió la mezcla de expresión libre de células y los pocillos se cerraron con una tapa. Las proteínas nacientes que contenían una etiqueta GST se unieron a la superficie del pocillo, lo que permitió una matriz NAPPA con mayor densidad y prácticamente sin contaminación cruzada. ^{[ 10 ]}

La técnica DAPA (DNA array to protein array) es un método desarrollado en 2007 para producir repetidamente matrices de proteínas mediante su impresión a partir de una única matriz de ADN plantilla, bajo demanda ^{[ 11 ]} (Figura 5). Comienza con la deposición e inmovilización de una matriz de plantillas de ADN sobre un portaobjetos de vidrio. A continuación, el portaobjetos se coloca frente a frente con un segundo portaobjetos previamente recubierto con un reactivo de captura de proteínas, y se interpone una membrana impregnada con extracto celular entre ambos para que se produzcan la transcripción y la traducción. Las proteínas con etiqueta His recién sintetizadas se inmovilizan en el portaobjetos para formar la matriz. En la publicación, en 18 de 20 réplicas se pudo generar una copia de la micromatriz de proteínas. Potencialmente, el proceso puede repetirse tantas veces como sea necesario, siempre que el ADN no se vea afectado por ADNasas, degradación o abrasión mecánica.

Este método evita la clonación de ADN (con la excepción de NAPPA) y permite convertir rápidamente la información genética en proteínas funcionales mediante PCR. La reducción de pasos en la producción y la posibilidad de miniaturizar el sistema permiten ahorrar reactivos y disminuir los costos de producción.

Muchas proteínas, incluidos los anticuerpos, son difíciles de expresar en células huésped debido a problemas de insolubilidad, enlaces disulfuro o toxicidad para las células huésped. ^{[ 1 ]} La matriz de proteínas sin células permite utilizar muchas de estas proteínas en microarrays de proteínas.

A diferencia del ADN, que es una molécula altamente estable, las proteínas constituyen una clase heterogénea de moléculas con diferente estabilidad y propiedades fisicoquímicas. Mantener el plegamiento y la función de las proteínas en un estado inmovilizado durante largos periodos de almacenamiento representa un gran desafío para los microarrays de proteínas. Los métodos libres de células ofrecen la opción de obtener microarrays de proteínas rápidamente y bajo demanda, eliminando así los problemas asociados con el almacenamiento a largo plazo.

El método es adaptable a una variedad de plantillas diferentes: productos de PCR, plásmidos y ARNm. Se pueden incluir componentes adicionales durante la síntesis para ajustar el entorno para el plegamiento de proteínas, la formación de enlaces disulfuro, la modificación o la actividad proteica. ^{[ 3 ]}