Microarray de lisado de proteína en fase inversa

Un microarreglo de lisado de proteínas en fase inversa ( RPMA ) es un microarreglo de proteínas diseñado como una plataforma de punto-borrón que permite medir los niveles de expresión de proteínas en una gran cantidad de muestras biológicas simultáneamente de manera cuantitativa cuando hay anticuerpos de alta calidad disponibles. ^[1]

Técnicamente, cantidades minúsculas de (a) lisados ​​celulares, de células intactas o células microdisecadas capturadas con láser, (b) fluidos corporales como suero, LCR, orina, vítreo, saliva, etc., se inmovilizan en puntos individuales en una micromatriz que luego se incuba con un solo anticuerpo específico para detectar la expresión de la proteína objetivo en muchas muestras. ^[2] Hay disponible un video resumen de RPPA. ^[3] Una micromatriz, según el diseño, puede acomodar cientos a miles de muestras que se imprimen en una serie de réplicas. La detección se realiza utilizando un anticuerpo marcado primario o secundario mediante ensayos quimioluminiscentes , fluorescentes o colorimétricos . Luego, se crea una imagen de la matriz y se cuantifican los datos obtenidos.

La multiplexación se logra al sondear múltiples matrices manchadas con el mismo lisado con diferentes anticuerpos simultáneamente y se puede implementar como un ensayo cuantitativo calibrado. ^[4] Además, dado que RPMA puede utilizar lisados ​​de células completas o no diseccionadas o microdisecadas, puede proporcionar información cuantificable directa sobre proteínas modificadas postraduccionalmente que no son accesibles con otras técnicas de alto rendimiento. ^{[5] [6]} Por lo tanto, RPMA proporciona datos proteómicos de alta dimensión de una manera cuantitativa, sensible y de alto rendimiento. ^[5] Sin embargo, dado que la señal generada por RPMA podría generarse a partir de la unión de anticuerpos primarios o secundarios inespecíficos, como se ve en otras técnicas como ELISA o inmunohistoquímica, la señal de un solo punto podría deberse a la reactividad cruzada . Por lo tanto, los anticuerpos utilizados en RPMA deben validarse cuidadosamente para determinar su especificidad y rendimiento frente a lisados ​​​​celulares mediante transferencia Western . ^{[1] [7]}

La RPMA tiene varios usos, como el análisis cuantitativo de la expresión de proteínas en células cancerosas, fluidos corporales o tejidos para la elaboración de perfiles de biomarcadores , el análisis de la señalización celular y el pronóstico clínico, el diagnóstico o la predicción terapéutica. ^[1] Esto es posible ya que se puede construir una RPMA con lisados ​​de diferentes líneas celulares y/o biopsias de tejido microdisecadas de captura láser de diferentes etapas de la enfermedad de varios órganos de uno o muchos pacientes para la determinación de la abundancia relativa o absoluta o la expresión diferencial de un nivel de marcador proteico en un solo experimento. También se utiliza para monitorear la dinámica de las proteínas en respuesta a varios estímulos o dosis de fármacos en múltiples puntos temporales. ^[1] Algunas otras aplicaciones para las que se utiliza la RPMA incluyen la exploración y el mapeo de las vías de señalización de proteínas, la evaluación de objetivos farmacológicos moleculares y la comprensión del mecanismo de acción de un fármaco candidato. ^[8] También se ha sugerido como una posible prueba de detección temprana en pacientes con cáncer para facilitar o guiar la toma de decisiones terapéuticas.

Otros microarrays de proteínas incluyen microarrays de proteínas directas (PMAs) y microarrays de anticuerpos (AMAs). Los PMAs inmovilizan proteínas recombinantes individuales purificadas y a veces desnaturalizadas en el microarray que son examinadas por anticuerpos y otros compuestos pequeños. Los AMA inmovilizan anticuerpos que capturan analitos de la muestra aplicada en el microarray. ^{[4] [6]} La proteína objetivo se detecta ya sea por etiquetado directo o un anticuerpo marcado secundario contra un epítopo diferente en la proteína objetivo del analito (enfoque sándwich). Tanto los PMA como los AMA pueden clasificarse como arreglos de fase directa ya que implican la inmovilización de un cebo para capturar un analito. En los arreglos de fase directa, cada arreglo se incuba con una muestra de prueba como un lisado celular o el suero de un paciente, pero se prueban múltiples analitos en la muestra simultáneamente. ^[4] La Figura 1 muestra un microarray de proteínas de fase directa (usando un anticuerpo como cebo aquí) y de fase inversa a nivel molecular.

Dependiendo de la pregunta de investigación o del tipo y objetivo del estudio, el RPMA puede diseñarse seleccionando el contenido del array, el número de muestras, la colocación de las muestras dentro de las microplacas, la disposición del array, el tipo de microarray, el anticuerpo de detección correcto, el método de detección de señales, la inclusión de control y el control de calidad de las muestras. A continuación, se realiza el experimento real en el laboratorio y se cuantifican y analizan los resultados obtenidos. Las etapas experimentales se enumeran a continuación:

Las células se cultivan en matraces T-25 a 37 grados y 5 % de CO2 _en un medio apropiado. ^[1] Según el diseño del estudio, una vez que las células están confluentes, se las puede tratar con fármacos, factores de crecimiento o se las puede irradiar antes del paso de lisis. Para los estudios de evolución temporal, se añade un estimulante a un conjunto de matraces simultáneamente y luego los matraces se procesan en diferentes puntos temporales. ^[1] Para los estudios de dosis de fármacos, se trata un conjunto de matraces con diferentes dosis del fármaco y todos los matraces se recogen al mismo tiempo. ^[1]

Si se va a realizar un RPMA que contiene lisados ​​de fracciones celulares de un tejido o tejidos, se utilizan métodos de microdisección por captura láser (LCM) o de aspiración con aguja fina para aislar células específicas de una región de tejido microscópicamente. ^{[4] [8]}

Los pellets de células recolectadas a través de cualquiera de los medios anteriores se lisan con un tampón de lisis celular para obtener una alta concentración de proteínas. ^[1]

Se agrupan alícuotas de los lisados ​​y se resuelven mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de una sola pista bidimensional seguida de transferencia Western en una membrana de nitrocelulosa. La membrana se corta en tiras de cuatro milímetros y cada tira se prueba con un anticuerpo diferente. Las tiras con una sola banda indican anticuerpos específicos que son adecuados para el uso en RPMA. El rendimiento de los anticuerpos también debe validarse con un tamaño de muestra más pequeño en condiciones idénticas antes de la recolección real de la muestra para RPMA. ^{[1] [7]}

Los lisados ​​celulares se recogen y se diluyen en serie de seis a diez veces si se utilizan técnicas colorimétricas, o sin dilución cuando se utiliza la detección fluorométrica (debido al mayor rango dinámico de fluorescencia que la detección colorimétrica). Las diluciones en serie se colocan luego en réplicas en una microplaca de 384 o 1536 pocillos. ^[1] Luego, los lisados ​​se imprimen en portaobjetos de vidrio recubiertos con membrana de nitrocelulosa o PVDF mediante un microarray como Aushon BioSystem 2470 o un robot Flexys (solución genómica). ^{[1] [9]} Aushon 2470 con un sistema de pines sólidos es la opción ideal, ya que se puede utilizar para producir matrices con lisados ​​muy viscosos y tiene control ambiental de humedad y sistema de suministro de portaobjetos automatizado. ^[1] Dicho esto, hay artículos publicados que muestran que los pines de impresión de microarrays Arrayit también se pueden utilizar y producir microarrays con un rendimiento mucho mayor utilizando menos lisado. ^[10] Los portaobjetos de vidrio recubiertos con membrana están disponibles comercialmente en varias empresas diferentes, como Schleicher y Schuell Bioscience (ahora propiedad de GE Whatman www.whatman.com), ^[9] Grace BioLabs (www.gracebio.com), Thermo Scientific y SCHOTT Nexterion (www.schott.com/nexterion). ^[11]

Después de imprimir las láminas, los sitios de unión no específicos en la matriz se bloquean utilizando un tampón de bloqueo como I-Block y las matrices se examinan con un anticuerpo primario seguido de un anticuerpo secundario. La detección se lleva a cabo generalmente con el sistema de amplificación de señal catalizada (CSA) DakoCytomation. Para la amplificación de la señal, las láminas se incuban con un complejo de estreptavidina-biotina-peroxidasa seguido de biotinil-tiramida/peróxido de hidrógeno y estreptavidina-peroxidasa. El revelado se completa utilizando peróxido de hidrógeno y se obtienen escaneos de las láminas (1). La amplificación de la señal de tiramida funciona de la siguiente manera: la peroxidasa de rábano picante inmovilizada (HRP) convierte la tiramida en un intermediario reactivo en presencia de peróxido de hidrógeno. La tiramida activada se une a las proteínas vecinas cerca de un sitio donde está unida la enzima HRP activadora. Esto conduce a una mayor deposición de moléculas de tiramida en el sitio; de ahí la amplificación de la señal. ^{[12] [13]}

Lance Liotta y Emanual Petricoin inventaron la técnica RPMA en 2001 (ver la sección de historia a continuación) y han desarrollado un método de detección multiplexada utilizando técnicas de fluorescencia de infrarrojo cercano. ^[14] En este estudio, informan el uso de un enfoque basado en colorante dual que puede duplicar efectivamente el número de puntos finales observados por matriz, lo que permite, por ejemplo, medir y analizar a la vez los niveles de proteína total y fosfoespecífica.

Una vez realizada la inmunotinción, se debe cuantificar la expresión de proteínas. Los niveles de señal se pueden obtener utilizando el modo reflectante de un escáner plano óptico ordinario si se utiliza una técnica de detección colorimétrica ^[1] o mediante escaneo láser, como con un sistema TECAN LS, si se utilizan técnicas fluorescentes. Luego se pueden utilizar dos programas disponibles en línea (P-SCAN y ProteinScan) para convertir la imagen escaneada en valores numéricos. ^[1] Estos programas cuantifican las intensidades de la señal en cada punto y utilizan un algoritmo de interpolación de dosis (DI ₂₅ ) para calcular un único valor de nivel de expresión de proteína normalizado para cada muestra. La normalización es necesaria para tener en cuenta las diferencias en la concentración de proteína total entre cada muestra y para que la tinción de anticuerpos se pueda comparar directamente entre muestras. ^[15] Esto se puede lograr realizando un experimento en paralelo en el que las proteínas totales se tiñen mediante tinción de proteína total con oro coloidal o tinción de proteína total con Sypro Ruby. ^[1] Cuando se analizan múltiples RPMA, los valores de intensidad de la señal se pueden mostrar como un mapa de calor, lo que permite el análisis de agrupamiento bayesiano y la elaboración de perfiles de las vías de señalización. ^[15] Una herramienta de software óptima, diseñada a medida para RPMA, se llama Microvigene, de Vigene Tech, Inc.

La mayor fortaleza de las RPMA es que permiten una detección ultrasensible, multiplexada y de alto rendimiento de proteínas a partir de cantidades extremadamente pequeñas de material de entrada, una hazaña que no se puede hacer con el Western blotting convencional o ELISA . ^{[1] [9]} El pequeño tamaño del punto en la micromatriz, que varía en diámetro de 85 a 200 micrómetros, permite el análisis de miles de muestras con el mismo anticuerpo en un experimento. ^[9] Las RPMA tienen una mayor sensibilidad y son capaces de detectar proteínas en el rango de picogramos. ^[9] Algunos investigadores incluso han informado de la detección de proteínas en el rango de attogramos. ^[9] Esta es una mejora significativa sobre la detección de proteínas por ELISA , que requiere cantidades de proteína de microgramos (6). El aumento de la sensibilidad de las RPMA se debe al formato en miniatura de la matriz, que conduce a un aumento de la densidad de la señal (intensidad de la señal/área) ^[9] junto con la mejora habilitada por la deposición de tiramida. La alta sensibilidad de los RPMA permite la detección de proteínas de baja abundancia o biomarcadores como las proteínas de señalización fosforiladas a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida, como muestras de biopsia , que a menudo están contaminadas con tejido normal. ^[4] Mediante el uso de microdisección por captura láser, se pueden analizar lisados ​​de tan solo 10 células, ^[4] y cada punto contiene menos de una centésima parte del equivalente celular de proteína.

Una gran mejora de los RPMAs sobre los arrays de proteínas de fase directa tradicionales es una reducción en la cantidad de anticuerpos necesarios para detectar una proteína. Los arrays de proteínas de fase directa generalmente utilizan un método sándwich para capturar y detectar la proteína deseada. ^{[4] [15]} Esto implica que debe haber dos epítopos en la proteína (uno para capturar la proteína y otro para detectar la proteína) para los cuales estén disponibles anticuerpos específicos. ^[15] Otros microarrays de proteínas de fase directa etiquetan directamente las muestras, sin embargo, a menudo hay variabilidad en la eficiencia del etiquetado para diferentes proteínas y, a menudo, el etiquetado destruye el epítopo al que se une el anticuerpo. ^[15] Este problema se supera con los RPMAs ya que no es necesario etiquetar la muestra directamente.

Otra ventaja de los RPMA en comparación con los microarrays de proteínas en fase directa y el Western blotting es la uniformidad de los resultados, ya que todas las muestras en el chip se analizan con el mismo anticuerpo primario y secundario y la misma concentración de reactivos de amplificación durante el mismo período de tiempo. ^[9] Esto permite cuantificar las diferencias en los niveles de proteína en todas las muestras. Además, la impresión de cada muestra en el chip en dilución seriada (colorimétrica) proporciona un control interno para garantizar que el análisis se realice solo en el rango dinámico lineal del ensayo. ^[4] De manera óptima, la impresión de calibradores y controles altos y bajos directamente en el mismo chip proporcionará una capacidad inigualable para medir cuantitativamente cada proteína a lo largo del tiempo y entre experimentos. Un problema que se encuentra con los microarrays de tejido es la recuperación de antígenos y la subjetividad inherente de la inmunohistoquímica. Los anticuerpos, especialmente los reactivos fosfoespecíficos, a menudo detectan secuencias de péptidos lineales que pueden estar enmascaradas debido a la conformación tridimensional de la proteína. ^[15] Este problema se supera con los RPMA, ya que las muestras se pueden desnaturalizar y revelar cualquier epítopo oculto. ^[15]

La mayor limitación de la RPMA, como es el caso de todos los inmunoensayos, es su dependencia de los anticuerpos para la detección de proteínas. Actualmente, existe un número limitado pero en rápido crecimiento de proteínas de señalización para las que existen anticuerpos que dan una señal analizable. ^[15] Además, encontrar el anticuerpo apropiado podría requerir una amplia selección de muchos anticuerpos mediante transferencia Western antes de comenzar el análisis RPMA. ^[1] Para superar este problema, se han creado dos bases de datos de recursos abiertos para mostrar los resultados de transferencia Western para anticuerpos que tienen una buena especificidad de unión dentro del rango esperado. ^{[1] [16] [17]} Además, las RPMA, a diferencia de las transferencias Western, no resuelven las fracciones de proteínas por peso molecular. ^[1] Por lo tanto, es fundamental que se realice una validación de anticuerpos por adelantado.

La RPMA se introdujo por primera vez en 2001 en un artículo de Lance Liotta y Emanuel Petricoin, quienes inventaron la tecnología. ^[8] Los autores utilizaron la técnica para analizar con éxito el estado de la proteína de punto de control pro-supervivencia en la etapa de transición microscópica utilizando microdisección por captura láser de epitelio prostático histológicamente normal, neoplasia intraepitelial prostática y cáncer de próstata invasivo emparejado con el paciente. ^[8] Desde entonces, la RPMA se ha utilizado en muchas investigaciones clínicas, traslacionales y de biología básica. Además, la técnica ahora se ha incorporado por primera vez a ensayos clínicos mediante los cuales se eligen pacientes con cánceres colorrectales y de mama metastásicos para la terapia en función de los resultados de la RPMA. Esta técnica ha sido comercializada para aplicaciones basadas en medicina personalizada por Theranostics Health, Inc.

• http://www.bio-itworld.com/BioIT_Article.aspx?id=97660
• http://discover.nci.nih.gov/abminer