Sonda de hibridación

En biología molecular , una sonda de hibridación ( HP ) es un fragmento de ADN o ARN , generalmente de 15 a 10000 nucleótidos de longitud, que puede ser marcado radiactivamente o fluorescentemente . Las HP se pueden usar para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos en el ARN o ADN analizado que son complementarias a la secuencia en la sonda. ^{[ 1 ]} La sonda marcada se desnaturaliza primero (por calentamiento o en condiciones alcalinas como la exposición a hidróxido de sodio ) en ADN monocatenario (ssDNA) y luego se hibrida con el ssDNA objetivo ( Southern blotting ) o ARN ( Northern blotting ) inmovilizado en una membrana o in situ .

Para detectar la hibridación de la sonda con su secuencia diana, la sonda se marca con un marcador molecular , ya sea radiactivo o (más recientemente) fluorescente. Los marcadores más comunes son el 32P ⁽ un isótopo radiactivo de fósforo incorporado al enlace fosfodiéster del ADN de la sonda), la digoxigenina (un marcador no radiactivo basado en anticuerpos ), la biotina o la fluoresceína. Las secuencias de ADN o los transcritos de ARN con una similitud de secuencia moderada a alta con la sonda se detectan visualizando la sonda hibridada mediante autorradiografía u otras técnicas de imagen. Normalmente, se toman radiografías del filtro o se coloca el filtro bajo luz ultravioleta. La detección de secuencias con similitud moderada o alta depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación: una rigurosidad alta, como una temperatura de hibridación elevada y una baja concentración de sal en los tampones de hibridación, solo permite la hibridación entre secuencias de ácidos nucleicos muy similares, mientras que una rigurosidad baja, como una temperatura más baja y una alta concentración de sal, permite la hibridación cuando las secuencias son menos similares.

Las sondas de hibridación utilizadas en los microarrays de ADN se refieren a ADN unido covalentemente a una superficie inerte, como portaobjetos de vidrio recubiertos o chips genéticos , a la cual se hibrida una secuencia diana de ADNc móvil . Según el método , la sonda puede sintetizarse mediante el método de fosforamidita , o puede generarse y marcarse mediante amplificación por PCR o clonación (ambos son métodos más antiguos). Para aumentar la estabilidad in vivo de la sonda, no se utiliza ARN. En su lugar, se pueden utilizar análogos de ARN , en particular derivados de morfolino . Las sondas moleculares basadas en ADN o ARN se utilizan habitualmente en el cribado de bibliotecas genéticas, la detección de secuencias de nucleótidos mediante métodos de transferencia y en otras tecnologías genéticas, como los microarrays de ácidos nucleicos y tejidos .

• Sondas Scorpion®
• Sondas Molecular Beacon
• Sondas TaqMan ®
• Sondas LNA® ( ácido nucleico bloqueado )
• Tecnología de sonda cíclica (CPT)
• Hibridación in situ
• Sondas binarias (divididas)
• Sondas multicomponente

En el campo de la ecología microbiana , se utilizan sondas de oligonucleótidos para determinar la presencia de especies, géneros o microorganismos microbianos clasificados a un nivel más amplio, como bacterias , arqueas y eucariotas , mediante hibridación fluorescente in situ (FISH). ^{[ 2 ]} Las sondas de ARNr han permitido a los científicos visualizar microorganismos que aún no se han cultivado en laboratorio, mediante la obtención de secuencias de ARNr directamente del medio ambiente. ^{[ 3 ]} Algunos ejemplos de este tipo de microorganismos son:

• Nevskia ramosa : N. ramosa es una bacteria neuston que forma rosetas típicas de ramificación dicotómica en la superficie de hábitats de agua dulce poco profundos. ^{[ 4 ]}
• Achromatium oxaliferum : Esta enorme bacteria (longitud celular de hasta >100 μm, diámetro de hasta 50 μm) contiene glóbulos de azufre e inclusiones masivas de calcita y habita en las capas superiores de los sedimentos de agua dulce. Es visible a simple vista y, debido a su resistencia al cultivo, ha desconcertado a generaciones de microbiólogos. ^{[ 5 ]}

En la ciencia forense, las sondas de hibridación se utilizan, por ejemplo, para la detección de regiones de repeticiones cortas en tándem ( microsatélites ) ^{[ 9 ]} y en métodos de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ( RFLP ), todos los cuales se utilizan ampliamente como parte del análisis de perfiles de ADN .

• Sonda molecular