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El complejo de prereplicación ( pre-RC ) es un complejo proteico que se forma en el origen de replicación durante la etapa de iniciación de la replicación del ADN . La formación del pre-RC es esencial para que se produzca la replicación del ADN. Una replicación completa y fiel del genoma garantiza que cada célula hija contenga la misma información genética que la célula madre. Por consiguiente, la formación del pre-RC es una parte fundamental del ciclo celular .
Componentes
A medida que los organismos evolucionaron y se volvieron cada vez más complejos, también lo hicieron sus pre-RC. A continuación, se presenta un resumen de los componentes del pre-RC en los diferentes dominios de la vida.
En las bacterias , el componente principal del pre-RC es DnaA . El pre-RC se completa cuando DnaA ocupa todos sus sitios de unión dentro del origen de replicación bacteriano ( oriC ). Los sitios específicos en el oriC a los que se une DnaA determinan si la célula tiene un bORC (complejo de reconocimiento del origen bacteriano) o un pre-RC. [ 1 ]
El pre-RC arqueal es muy diferente del pre-RC bacteriano y puede servir como un modelo simplificado del pre-RC eucariota. Está compuesto por una proteína del complejo de reconocimiento de origen (ORC), Cdc6 / ORC1 , y un homohexámero de la proteína de mantenimiento del minicromosoma (MCM). Sulfolobus islandicus también utiliza un homólogo de Cdt1 para reconocer uno de sus orígenes de replicación. [ 2 ]
El pre-RC eucariota es el más complejo y regulado. En la mayoría de los eucariotas, está compuesto por seis proteínas ORC (ORC1-6), Cdc6 , Cdt1 y un heterohexámero de las seis proteínas MCM (MCM2-7). Se cree que el heterohexámero MCM surgió mediante eventos de duplicación del gen MCM y posterior evolución divergente. El pre-RC de Schizosaccharomyces pombe ( S. pombe ) es notablemente diferente al de otros eucariotas; Cdc6 es reemplazado por la proteína homóloga Cdc18. Sap1 también está incluido en el pre-RC de S. pombe porque es necesario para la unión de Cdc18. El pre-RC de Xenopus laevis ( X. laevis ) también tiene una proteína adicional, MCM9, que ayuda a cargar el heterohexámero MCM en el origen de replicación. [ 3 ] Se ha resuelto la estructura del ORC, MCM, así como del complejo intermedio ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7 (OCCM). [ 4 ]
Reconocimiento del origen de la replicación
El reconocimiento del origen de la replicación es un primer paso fundamental en la formación del pre-RC. En los distintos dominios de la vida, este proceso se lleva a cabo de manera diferente.
En procariotas, el reconocimiento del origen se lleva a cabo mediante DnaA. DnaA se une firmemente a una secuencia consenso de 9 pares de bases en oriC: 5' – TTATCCACA – 3'. Existen 5 secuencias de 9 pb (R1-R5) y 4 secuencias no consenso (I1-I4) dentro de oriC a las que DnaA se une con afinidad diferencial. DnaA se une a R4, R1 y R2 con alta afinidad y a R5, I1, I2, I3 y R3 con menor afinidad. [ 5 ] In vivo, se ha observado que la unión de DnaA a los sitios de reconocimiento ocurre en el orden: R1, R2, luego R4, que forma el bORC. Posteriormente, los otros sitios de reconocimiento de 9 pb de menor afinidad se unen a DnaA, que forma el pre-RC. [ 6 ]
Las arqueas poseen entre uno y tres orígenes de replicación. Estos orígenes suelen ser secuencias ricas en AT que varían según la especie. La proteína ORC, exclusiva de las arqueas, reconoce estas secuencias ricas en AT y se une al ADN de forma dependiente de ATP.
Los eucariotas suelen tener múltiples orígenes de replicación; al menos uno por cromosoma. Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) es el único eucariota conocido con una secuencia de iniciación definida TTTTTATG/ATTTA/T. [ 7 ] Esta secuencia de iniciación es reconocida por ORC1-5. No se sabe que ORC6 se una al ADN en S. cerevisiae . Las secuencias de iniciación en S. pombe y eucariotas superiores no están bien definidas. Sin embargo, las secuencias de iniciación generalmente son ricas en AT o presentan una topología de ADN curvada o doblada. Se sabe que la proteína ORC4 se une a la porción rica en AT del origen de replicación en S. pombe mediante motivos de gancho AT . El mecanismo de reconocimiento del origen en eucariotas superiores no se comprende bien, pero se cree que las proteínas ORC1-6 dependen de una topología de ADN inusual para la unión. [ 8 ]
Cargando
El ensamblaje del complejo de prereplicación solo ocurre durante la fase M tardía y la fase G1 temprana del ciclo celular, cuando la actividad de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) es baja. Esta sincronización y otros mecanismos reguladores aseguran que la replicación del ADN ocurra solo una vez por ciclo celular. El ensamblaje del complejo de prereplicación depende del reconocimiento previo del origen, ya sea por DnaA en procariotas o por ORC en arqueas y eucariotas.
El pre-RC de los procariotas se completa cuando DnaA ocupa todos los posibles sitios de unión dentro del oriC. DnaA solo puede unirse a los sitios de baja afinidad en el oriC una vez que la proteína fis se elimina del oriC. Tras la eliminación de fis, la proteína IHF (factor del huésped integrado) se une a un sitio entre R1 y R2, lo que permite que DnaA se una a los sitios de baja afinidad en el oriC. Esto completa el pre-RC. [ 9 ]
El pre-RC de las arqueas requiere la unión del ORC al origen. Posteriormente, Cdc6 y el complejo homohexamérico MCM se unen de forma secuencial.
Los eucariotas poseen el pre-RC más complejo. Tras la unión de ORC1-6 al origen de replicación, se recluta Cdc6. Cdc6 recluta el factor de licencia Cdt1 y MCM2-7. La unión de Cdt1 y la hidrólisis de ATP por parte de ORC y Cdc6 cargan MCM2-7 sobre el ADN. Existe un exceso estequiométrico de las proteínas MCM sobre las proteínas ORC y Cdc6, lo que indica que podría haber múltiples heterohexámeros MCM unidos a cada origen de replicación. [ 3 ]
Inicio de la replicación
Una vez formado el complejo pre-RC, este debe activarse y el replisoma debe ensamblarse para que se produzca la replicación del ADN.
En procariotas, DnaA hidroliza ATP para desenrollar el ADN en el oriC. Esta región desnaturalizada es accesible a la helicasa DnaB y al cargador de helicasa DnaC . Las proteínas de unión a cadena sencilla estabilizan la burbuja de replicación recién formada e interactúan con la primasa DnaG . DnaG recluta la ADN polimerasa III replicativa y comienza la replicación.
En eucariotas, el heterohexámero MCM es fosforilado por CDC7 y CDK, lo que desplaza a Cdc6 y recluta a MCM10 . MCM10 coopera con MCM2-7 en el reclutamiento de Cdc45 . Cdc45 recluta entonces componentes clave del replisoma : la ADN polimerasa replicativa α y su primasa. La replicación del ADN puede entonces comenzar. [ 10 ]
Prevención del reensamblaje del complejo de prereplicación
Durante cada ciclo celular, es fundamental que el genoma se replique completamente una sola vez. La formación del complejo de prereplicación durante la fase M tardía y la fase G1 temprana es necesaria para la replicación del genoma, pero una vez replicado, este complejo no debe formarse de nuevo hasta el siguiente ciclo celular.
En procariotas, diversos estudios han demostrado que el pre-RC es un complejo que solo está presente durante una fracción del ciclo celular. Una vez que ocurre una división celular, el pre-RC debe revertir al bORC para asegurar que solo ocurra una ronda de replicación del ADN durante la división. En E. coli , existen 11 sitios GATC en el oriC que sufren hemimetilación durante la replicación del ADN. La proteína SeqA se une a estos sitios, impidiendo la remetilación y bloqueando la unión de DnaA a sitios de baja afinidad durante aproximadamente un tercio del ciclo celular. Sin embargo, SeqA no impide que DnaA se una a los sitios R1, R2 y R4. Por lo tanto, el bORC se reinicia y se prepara para sufrir otra conversión al pre-RC. [ 11 ]
En S. cerevisiae, las CDK previenen la formación del complejo de replicación durante las fases G1 tardía, S y G2 al excluir MCM2-7 y Cdt1 del núcleo, dirigir Cdc6 para su degradación por el proteasoma y disociar ORC1-6 de la cromatina mediante fosforilación . [ 12 ] La prevención de la replicación repetida en S. pombe es ligeramente diferente; Cdt1 es degradado por el proteasoma en lugar de simplemente ser excluido del núcleo. [ 13 ] La regulación proteolítica de Cdt1 es compartida por eucariotas superiores, incluyendo Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster , X. laevis y mamíferos . Los metazoos tienen un cuarto mecanismo para prevenir la replicación repetida ; durante S y G2, geminin se une a Cdt1 e inhibe que Cdt1 cargue MCM2-7 en el origen de replicación. [ 8 ]
Síndrome de Meier-Gorlin
Se sabe que los defectos en los componentes del complejo de replicación eucariota causan el síndrome de Meier-Gorlin , que se caracteriza por enanismo , rótulas ausentes o hipoplásicas , orejas pequeñas, retraso del crecimiento pre y postnatal y microcefalia . [ 14 ] [ 15 ] Se conocen mutaciones en los genes ORC1 , ORC4 , ORC6 , CDT1 y CDC6 . [ 15 ] El fenotipo de la enfermedad probablemente se origina por una capacidad reducida de las células para proliferar , lo que lleva a una disminución del número de células y a un fallo general del crecimiento. [ 16 ]
Referencias
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- replicación del ADN
