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ADNG

DnaG es una primasa de ADN bacteriana codificada por el gen dnaG . Esta enzima, al igual que otras primasas de ADN, sintetiza cadenas cortas de ARN llamadas oligonucleótidos dur...

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DnaG es una primasa de ADN bacteriana codificada por el gen dnaG . Esta enzima, al igual que otras primasas de ADN, sintetiza cadenas cortas de ARN llamadas oligonucleótidos durante la replicación del ADN . Estos oligonucleótidos se conocen como cebadores , ya que actúan como punto de partida para la síntesis de ADN. DnaG cataliza la síntesis de oligonucleótidos de entre 10 y 60 nucleótidos (la unidad fundamental del ADN y el ARN), aunque la mayoría de los oligonucleótidos sintetizados tienen 11 nucleótidos. [ 1 ] Estos oligonucleótidos de ARN sirven como cebadores, o puntos de partida, para la síntesis de ADN por la ADN polimerasa III bacteriana (Pol III). DnaG es importante en la replicación del ADN bacteriano porque la ADN polimerasa no puede iniciar la síntesis de una cadena de ADN, sino que solo puede añadir nucleótidos a una cadena preexistente. [ 2 ] DnaG sintetiza un único cebador de ARN en el origen de replicación . Este cebador sirve para iniciar la síntesis de la cadena conductora de ADN. Para la otra hebra parental, la hebra rezagada , DnaG sintetiza un cebador de ARN cada pocos kilobases (kb). Estos cebadores sirven como sustratos para la síntesis de fragmentos de Okazaki . [ 3 ]

En E. coli, DnaG se asocia mediante interacciones no covalentes con la helicasa replicativa bacteriana DnaB para realizar su actividad primasa, asociándose tres proteínas primasa DnaG con cada helicasa DnaB para formar el primosoma . [ 4 ] Las primasas tienden a iniciar la síntesis en secuencias específicas de tres nucleótidos en plantillas de ADN monocatenario (ssDNA) y, para E. coli , la secuencia es 5'-CTG-3'. [ 1 ]

DnaG contiene tres dominios proteicos distintos : un dominio de unión al zinc, un dominio de ARN polimerasa y un dominio de unión a la helicasa DnaB. Varias bacterias utilizan la primasa de ADN DnaG. Algunos organismos que tienen DnaG como su primasa de ADN son Escherichia coli ( E. coli ), Bacillus stearothermophilus y Mycobacterium tuberculosis (MTB). La DnaG de E. coli tiene un peso molecular de 60 kilodaltons (kDa) y contiene 581 aminoácidos .

Función

La DnaG (primasa de ADN) es una enzima esencial implicada en la horquilla de replicación del ADN.
Mecanismo orgánico de síntesis de oligonucleótidos de ácido ribonucleico (ARN) en dirección 5' a 3'.

La DnaG cataliza la síntesis de oligonucleótidos en cinco pasos distintos: unión al molde, unión al nucleósido trifosfato (NTP), iniciación, extensión para formar un cebador y transferencia del cebador a la ADN polimerasa III. [ 1 ] La DnaG realiza esta catálisis cerca de la horquilla de replicación que se forma por la helicasa DnaB durante la replicación del ADN. La DnaG debe formar un complejo con la DnaB para poder catalizar la formación de los cebadores de oligonucleótidos. [ 1 ]

El mecanismo de síntesis de cebadores por primasas implica dos sitios de unión de NTP en la proteína primasa (DnaG). [ 5 ] Antes de la unión de cualquier NTP para formar el cebador de ARN, la secuencia molde de ssDNA se une a DnaG. El ssDNA contiene una secuencia de reconocimiento de tres nucleótidos que recluta NTPs según el apareamiento de bases de Watson-Crick . [ 1 ] Después de unirse al ADN, DnaG debe unirse a dos NTPs para generar un complejo cuaternario enzima-ADN-NTP-NTP. Las constantes de Michaelis (km) para los NTPs varían según la primasa y las plantillas. [ 6 ] Los dos sitios de unión de NTP en DnaG se denominan sitio de iniciación y sitio de elongación. El sitio de iniciación es el sitio donde se une el NTP que se incorporará al extremo 5' del cebador. El sitio de elongación se une al NTP que se agrega al extremo 3' del cebador.

Una vez que dos nucleótidos se unen a la primasa, DnaG cataliza la formación de un dinucleótido mediante la formación de un enlace fosfodiéster a través de la síntesis por deshidratación entre el hidroxilo 3' del nucleótido en el sitio de iniciación y el fosfato α del nucleótido en el sitio de elongación. Esta reacción da como resultado un dinucleótido y la ruptura del enlace entre el fósforo α y β, liberando pirofosfato. Esta reacción es irreversible porque el pirofosfato que se forma es hidrolizado en dos moléculas de fosfato inorgánico por la enzima pirofosfatasa inorgánica . [ 7 ] Esta reacción de síntesis de dinucleótidos es la misma reacción que cualquier otra enzima que cataliza la formación de ADN o ARN ( ADN polimerasa , ARN polimerasa ), por lo tanto, DnaG siempre debe sintetizar oligonucleótidos en la dirección 5' a 3'. En E. coli , los cebadores comienzan con un dinucleótido de adenina-guanina trifosfato (pppAG) en el extremo 5'.

Para que se produzca una mayor elongación del dinucleótido, el oligonucleótido debe desplazarse de manera que el NTP 3' se transfiera del sitio de elongación al sitio de iniciación, permitiendo que otro NTP se una al sitio de elongación y se adhiera al hidroxilo 3' del oligonucleótido. Una vez sintetizado un oligonucleótido de la longitud adecuada en la etapa de elongación de la síntesis del cebador, DnaG transfiere el cebador recién sintetizado a la ADN polimerasa III para que sintetice la cadena conductora de ADN o los fragmentos de Okazaki para la cadena rezagada. [ 1 ] La etapa limitante de la velocidad de la síntesis del cebador ocurre después de la unión del NTP, pero antes o durante la síntesis del dinucleótido. [ 6 ]

Estructura

La primasa DnaG de E. coli es una proteína monomérica de 581 residuos con tres dominios funcionales, según estudios de proteólisis. Presenta un dominio de unión a zinc N-terminal (residuos 1-110) donde un ion zinc se coordina tetraédricamente entre un residuo de histidina y tres de cisteína, lo que desempeña un papel en el reconocimiento de sitios de unión al ADN específicos de secuencia. El dominio central (residuos 111-433) muestra actividad de ARN polimerasa y es el sitio de síntesis del cebador de ARN. El dominio C-terminal (residuos 434-581) es responsable de la unión no covalente de DnaG a la proteína helicasa DnaB . [ 8 ]

Dominio de unión al zinc

Izquierda: Estructura del dominio de unión al zinc de Bacillus stearothermophilus , con los residuos hidrofóbicos y básicos conservados mostrados en plata. Derecha: Imagen ampliada del sitio de unión al zinc que muestra Cys40, Cys61, Cys64 e His43 coordinando un ion zinc. Diagrama generado a partir de PDB 1D0Q .

El dominio de unión al zinc, responsable del reconocimiento de sitios de unión al ADN específicos de secuencia, se conserva en todas las primasas de ADN virales, de bacteriófagos, procariotas y eucariotas. [ 9 ] El dominio de unión al zinc de la primasa forma parte de la subfamilia de dominios de unión al zinc conocida como cinta de zinc . Los dominios de cinta de zinc se caracterizan por dos bucles de horquilla β que forman el dominio de unión al zinc. Normalmente, se cree que los dominios de cinta de zinc carecen de hélices α , lo que los distingue de otros dominios de unión al zinc. Sin embargo, en el año 2000, el dominio de unión al zinc de DnaG se cristalizó a partir de Bacillus stearothermophilus, revelando que el dominio consistía en una lámina β antiparalela de cinco hebras adyacente a cuatro hélices α y una hélice 3 10 en el extremo C-terminal del dominio. [ 9 ]

El sitio de unión al zinc de B. stearothermophilus consta de tres residuos de cisteína, Cys40, Cys61 y Cys64, y un residuo de histidina, His43. Cys40 e His43 se encuentran en la horquilla β entre la segunda y la tercera lámina β. [ 9 ] Cys61 se encuentra en la quinta lámina β, y Cys64 en la horquilla β entre la cuarta y la quinta lámina β. Estos cuatro residuos coordinan el ion zinc tetraédricamente. Se cree que el ion zinc estabiliza los bucles entre la segunda y la tercera lámina β, así como entre la cuarta y la quinta. El dominio se estabiliza aún más mediante una serie de interacciones hidrofóbicas entre la superficie interna hidrofóbica de la lámina β, que se encuentra empaquetada contra la segunda y la tercera hélice α. La superficie externa de la lámina β también tiene muchos residuos hidrofóbicos y básicos conservados. Estos residuos son Lys30, Arg34, Lys46, Pro48, Lys56, Ile58, His60 y Phe62. [ 9 ]

Unión al ADN

Se cree que la función del dominio de unión al zinc es el reconocimiento de secuencias de ADN específicas. Las primasas de ADN sintetizan cebadores de ARN que luego se utilizan para la síntesis de ADN. La ubicación de los cebadores de ARN no es aleatoria, lo que sugiere que se colocan en secuencias de ADN específicas. De hecho, se ha demostrado que otras primasas de ADN reconocen secuencias de tripletes; la secuencia específica reconocida por B. stearothermophilus aún no se ha identificado. [ 9 ] Se ha demostrado que si los residuos de cistina que coordinan el ion zinc están mutados, la primasa de ADN deja de funcionar. Esto indica que el dominio de unión al zinc desempeña un papel en el reconocimiento de secuencias. Además, la superficie hidrofóbica de la lámina β, así como los residuos básicos que se agrupan principalmente en un borde de la lámina, sirven para atraer ADN monocatenario, facilitando aún más la unión al ADN. [ 9 ]

Basándonos en estudios previos sobre la unión del ADN a las primasas de ADN, se cree que el ADN se une al dominio de unión al zinc a través de la superficie de la lámina β, con los tres nucleótidos uniéndose a través de tres hebras de la lámina β. [ 9 ] Los residuos con carga positiva en la lámina podrían formar contactos con los fosfatos y los residuos aromáticos formarían interacciones de apilamiento con las bases. Este es el modelo de unión del ADN por el dominio de unión al ADN monocatenario de la proteína de replicación A (RPA) . [ 9 ] Es lógico suponer que el dominio de unión al zinc de B. stearothermophilus se une al ADN de manera similar, ya que los residuos importantes para la unión del ADN en RPA se encuentran en posiciones estructuralmente equivalentes en B. stearothermophilus . [ 9 ]

Dominio de la ARN polimerasa

Estructura del dominio de la ARN polimerasa DnaG de E. coli . Los residuos básicos altamente conservados, Arg146, Arg221 y Lys229, se muestran en amarillo. Esta imagen se generó a partir de PDB 1DD9 .

Como su nombre lo indica, el dominio de la ARN polimerasa (RNAP) de DnaG es responsable de sintetizar los cebadores de ARN en el ADN monocatenario. In vivo, DnaG puede sintetizar fragmentos de cebadores de hasta 60 nucleótidos, pero estos fragmentos se limitan a aproximadamente 11 nucleótidos. [ 10 ] Durante la síntesis de la cadena rezagada, DnaG sintetiza entre 2000 y 3000 cebadores a una velocidad de un cebador por segundo. [ 10 ]

El dominio RNAP de DnaG tiene tres subdominios: el dominio N-terminal, que presenta un plegamiento mixto α y β; el dominio central, que consta de una lámina β de 5 hebras y 6 hélices α; y, finalmente, el dominio C-terminal, que está formado por un haz helicoidal compuesto por 3 hélices α antiparalelas. El dominio central está formado en parte por el plegamiento toprim , un plegamiento que se ha observado en muchas proteínas de fosfotransferencia que se unen a metales. El dominio central y el dominio N-terminal forman una hendidura poco profunda, que constituye el sitio activo de la elongación de la cadena de ARN en DnaG. [ 10 ] La abertura de la hendidura está revestida por varios residuos básicos altamente conservados: Arg146, Arg221 y Lys229. Estos residuos forman parte de la cresta electrostáticamente positiva del subdominio N-terminal. Es esta cresta la que interactúa con el ADN monocatenario y ayuda a guiarlo hacia la hendidura, que consta del centro de unión al metal del motivo toprim en el subdominio central y los motivos primasa conservados del dominio N-terminal. [ 10 ] El sitio de unión al metal del dominio toprim es donde se sintetiza el cebador. El dúplex ARN:ADN sale luego a través de otra depresión básica.

Dominio C-terminal

Estructura del dominio de unión a la helicasa de E. coli . Representada a partir de PDB 2R6A . Las dos hélices inferiores forman la horquilla helicoidal del subdominio C2. Las cinco hélices restantes forman el haz helicoidal del subdominio C1.

A diferencia de los dominios de unión al zinc y los dominios de la ARN polimerasa, los dominios C-terminales de las primasas de ADN no están conservados. En las primasas procariotas, la única función conocida de este dominio es interactuar con la helicasa DnaB. [ 1 ] Por lo tanto, este dominio se denomina dominio de unión a la helicasa (HBD). El HBD de DnaG consta de dos subdominios: un haz helicoidal , el subdominio C1, y una horquilla helicoidal, el subdominio C2. [ 4 ] [ 11 ] Para cada una de las dos o tres moléculas de DnaG que se unen al hexámero de DnaB, los subdominios C1 de los HBD interactúan con DnaB en sus dominios N-terminales en la superficie interna del anillo del hexámero, mientras que los subdominios C2 interactúan con los dominios N-terminales en la superficie externa del hexámero.

DnaG de Bacillus stearothermophilus , azul, en complejo con la DnaB hexamérica, verde. Generado a partir de PDB 2R6A.

Se han identificado tres residuos en DnaB de B. stearothermophilus como importantes para la formación de la interfaz DnaB, DnaG. Estos residuos incluyen Tyr88, Ile119 e Ile125. [ 4 ] Tyr88 está cerca, pero no hace contacto con, el HBD de DnaG. La mutación de Tyr88 inhibe la formación del haz helicoidal del dominio N-terminal de DnaB, interrumpiendo los contactos con el HBD de DnaG. [ 4 ] La estructura hexamérica de DnaB es en realidad un trímero de dímeros. Tanto Ile119 como Ile125 están enterrados en la interfaz del dímero del dominio N-terminal de DnaB y la mutación de estos residuos inhibe la formación de la estructura hexamérica y por lo tanto la interacción con DnaG. [ 4 ] Otro residuo que se ha identificado como que juega un papel crucial en la interacción de DnaB y DnaG es Glu15. La mutación de Glu15 no interrumpe la formación del complejo DnaB, DnaG, sino que desempeña un papel en la modulación de la longitud de los cebadores sintetizados por DnaG. [ 4 ]

Inhibición de DnaG

Análogos de NTP que se sabe que inhiben la DnaG, así como otras enzimas polimerasas.

Los inhibidores de las primasas de ADN son compuestos valiosos para la elucidación de vías bioquímicas e interacciones clave, pero también son de interés como compuestos principales para el diseño de fármacos contra enfermedades bacterianas. La mayoría de los compuestos conocidos que inhiben las primasas son análogos de nucleótidos como AraATP (véase Vidarabina ) y 2-fluoro-AraATP. Estos compuestos suelen ser utilizados como sustratos por la primasa, pero una vez incorporados, la síntesis o elongación ya no puede ocurrir. Por ejemplo, la DnaG de E. coli utiliza 2',3'-dideoxinucleósido 5'-trifosfatos (ddNTP) como sustratos, que actúan como terminadores de cadena debido a la falta de un hidroxilo en 3' para formar un enlace fosfodiéster con el siguiente nucleótido. [ 1 ]

El número relativamente pequeño de inhibidores de primasa probablemente refleja la dificultad inherente de los ensayos de primasa más que una falta de sitios de unión potenciales en la enzima. La corta longitud de los productos sintetizados y la velocidad generalmente lenta de la enzima en comparación con otras enzimas de replicación dificultan el desarrollo de enfoques de cribado de alto rendimiento (HTS). [ 6 ] A pesar de las dificultades, existen varios inhibidores conocidos de DnaG que no son análogos de NTP. La doxorrubicina y la suramina son inhibidores competitivos de ADN y NTP de Mycobacterium tuberculosis DnaG. [ 12 ] También se sabe que la suramina inhibe la primasa de ADN eucariota compitiendo con GTP, por lo que es probable que la suramina inhiba DnaG a través de un mecanismo similar. [ 1 ]

Referencias

  1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Frick DN, Richardson CC (2001). "ADN primasa". Annual Review of Biochemistry . 70 : 39– 80. doi : 10.1146/annurev.biochem.70.1.39 . PMID 11395402 . S2CID 33197061 .  
  2. ↑ Russell P (2009). iGenetics: Un enfoque molecular (3.ª ed.). Benjamin Cummings. págs. 42–43 . ISBN   978-0321772886.
  3. ↑ Nelson D, Cox M (2008). Principios de bioquímica de Lehninger (5.ª ed.). Nueva York: WH Freeman and Company. págs. 986–989 . ISBN   978-0716771081.
  4. 1 2 3 4 5 6 Bailey S, Eliason WK, Steitz TA (19 de octubre de 2007). "Estructura de la helicasa DnaB hexamérica y su complejo con un dominio de la primasa DnaG" . Science . 318 (5849): 459– 63. Bibcode : 2007Sci...318..459B . doi : 10.1126/science.1147353 . PMID 17947583 . 
  5. ↑ Frick DN, Kumar S, Richardson CC (10 de diciembre de 1999). "Interacción de los ribonucleósidos trifosfatos con la primasa del gen 4 del bacteriófago T7" . Journal of Biological Chemistry . 274 (50): 35899–907 . doi : 10.1074/jbc.274.50.35899 . PMID 10585475 . 
  6. 1 2 3 Kuchta RD, Stengel G (mayo de 2010). "Mecanismo y evolución de las primasas de ADN" . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteínas y proteómica . 1804 (5): 1180– 9. doi : 10.1016 / j.bbapap.2009.06.011 . PMC 2846230. PMID 19540940 .  
  7. ↑ Bruice PY (2007). Química orgánica (5.ª ed.). Pearson Education, Inc. págs. 1202–1203 . ISBN   978-0-13-199631-1.
  8. ^ Voet, Donald (2010). Bioquímica (4ª ed.). Nueva York: J. Wiley & Sons. pag. 1189 . ISBN   978-0-470-57095-1.
  9. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Pan H, Wigley DB (15 de marzo de 2000). "Estructura del dominio de unión al zinc de la primasa de ADN de Bacillus stearothermophilus" . Structure . 8 (3): 231– 9. doi : 10.1016/S0969-2126(00)00101-5 . PMID 10745010 . 
  10. 1 2 3 4 Keck JA, Roche DD, Lynch AS, Berger JM (31 de marzo de 2000). "Estructura del dominio de la ARN polimerasa de la primasa de E. coli". Science . 287 (5462): 2482– 6. Bibcode : 2000Sci...287.2482K . doi : 10.1126/science.287.5462.2482 . PMID 10741967 . S2CID 27005599 .  
  11. ↑ Oakley AJ, Loscha KV, Schaeffer PM, Liepinsh E, Pintacuda G, Wilce MCJ, Otting G, Dixon NE (15 de enero de 2005). "Estructuras cristalinas y en solución del dominio de unión a la helicasa de la primasa de Escherichia coli " . The Journal of Biological Chemistry . 280 (12): 11495– 11504. doi : 10.1074/jbc.M412645200 . PMID 15649896 . 
  12. ↑Biswas T, Resto-Roldan E, Sawyer SK, Artsimovitch I, Tsodikov OV (December 2012). "A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG". Nucleic Acids Research. 41 (4): e56. doi:10.1093/nar/gks1292. PMC 3575809. PMID 23267008.

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