ADN

DnaA es una proteína que activa el inicio de la replicación del ADN en bacterias. ^{[ 1 ]} Según el modelo del replicón, una molécula iniciadora positivamente activa se une a un punto específico de un cromosoma circular llamado replicador para iniciar la replicación del ADN. ^{[ 2 ]} Es un factor de iniciación de la replicación que promueve el desenrollamiento del ADN en oriC. ^{[ 1 ]} Las proteínas DnaA presentes en todas las bacterias se unen a las cajas DnaA para iniciar la replicación cromosómica. El inicio de la fase de iniciación de la replicación del ADN está determinado por la concentración de DnaA. ^{[ 1 ]} DnaA se acumula durante el crecimiento y luego desencadena el inicio de la replicación. ^{[ 1 ]} La replicación comienza con la unión activa de DnaA a repeticiones de 9 mer (9 pb) aguas arriba de oriC. ^{[ 1 ]} La unión de DnaA conduce a la separación de las hebras en las repeticiones de 13 mer. ^{[ 1 ]} Esta unión hace que el ADN forme un bucle en preparación para su desnaturalización por la helicasa DnaB. ^{[ 1 ]}

DnaA se compone principalmente de dos formas diferentes: la forma activa unida a ATP y la forma inactiva unida a ADP . ^{[ 1 ] [ 3 ]} El nivel de DnaA activa dentro de una célula es bajo inmediatamente después de que la célula se haya dividido. ^{[ 1 ]} Aunque la forma activa de DnaA requiere ATP, la formación del complejo oriC /DnaA y el posterior desenrollamiento del ADN no requieren hidrólisis de ATP . ^{[ 4 ]}

El sitio oriC en E. coli tiene tres regiones ricas en AT de 13 pares de bases ( DUE ) seguidas de cuatro regiones de 9 pb con la secuencia TTAT( C o A)CA(C o A)A. ^{[ 5 ]} Las moléculas de DnaA se unen a las regiones de 9 pb, que se enrollan alrededor de las proteínas, lo que provoca que el ADN en la región rica en AT se desenrolle. ^{[ 6 ]} Actualmente se han identificado 11 sitios de unión de DnaA dentro de oriC , a los que DnaA se une con afinidad diferencial. ^{[ 6 ]} Cuando la replicación del ADN está a punto de comenzar, DnaA ocupa todos los sitios de unión de alta y baja afinidad. La región rica en AT desnaturalizada permite el reclutamiento de DnaB ( helicasa ), que forma un complejo con DnaC (cargador de helicasa). DnaC ayuda a la helicasa a unirse y acomodar adecuadamente el ssDNA en la región de 13 pb; esto se logra mediante la hidrólisis de ATP , después de lo cual DnaC se libera. Las proteínas de unión a cadena simple (SSB) estabilizan las cadenas de ADN individuales para mantener la burbuja de replicación . DnaB es una helicasa 5'→3', por lo que se desplaza sobre la cadena rezagada . Se asocia con DnaG (una primasa ) para formar el único cebador de la cadena conductora y añadir cebadores de ARN a la cadena rezagada. La interacción entre DnaG y DnaB es necesaria para controlar la longitud de los fragmentos de Okazaki en la cadena rezagada. La ADN polimerasa III puede entonces iniciar la replicación del ADN .

DnaA está compuesta por cuatro dominios: el primero es el N-terminal que se asocia con proteínas reguladoras, el segundo es una región de enlace helicoidal, el tercer dominio es una región AAA+ que se une al ATP, y el cuarto dominio es la región de unión al ADN del extremo C. ^{[ 7 ]} DnaA contiene dos regiones conservadas : la primera se encuentra en la parte central de la proteína y corresponde al dominio de unión al ATP, la segunda se encuentra en la mitad C-terminal y participa en la unión al ADN. ^{[ 8 ]}

Las primeras cepas que presentaron la mutación del gen dnaA fueron las cepas termosensibles K-12 CRT46 y CRT83, con los números de cepa correspondientes dnaA46 y dnaA83. A diferencia de los mutantes dnaA, la cepa PC2 presenta una mutación en el gen dnaC, que codifica el factor de carga para la helicasa de ADN dnaB. ^{[ 9 ]}

DnaA tiene la capacidad de unirse a su propio promotor . Cuando DnaA se une a su promotor, bloquea la unión de la ARN polimerasa al mismo e inhibe el inicio de la transcripción . De esta manera, DnaA puede regular su propia expresión. ^{[ 3 ] [ 10 ]} Este proceso se denomina autorregulación . ^{[ 11 ]}

Cada ciclo de división celular desencadena una nueva ronda de replicación cromosómica con la acumulación de DnaA, la proteína iniciadora, en la región OriC del ADN. ^{[ 12 ]} Es crucial regular las interacciones del monómero DnaA-ATP con oriC durante la carga de la helicasa y el desenrollamiento del ADN de origen para una sincronización precisa. Los sitios de reconocimiento de DnaA en Escherichia coli están dispuestos en OriC para facilitar el ensamblaje del complejo de pre-replicación por etapas, con DnaA interactuando con sitios de baja afinidad a medida que se oligomeriza para llenar los huecos entre los sitios de alta afinidad a medida que se oligomeriza. Puede haber numerosas estrategias de llenado de huecos para vincular las funciones de OriC con los estilos de vida bacterianos en la naturaleza, lo que puede explicar la amplia variabilidad de los patrones de sitios de reconocimiento de DnaA de OriC. ^{[ 4 ]} Las dos formas de DnaA, la forma activa ATP y la forma ADP están reguladas. La forma ATP se convierte en la forma ADP mediante la inactivación reguladora de DnaA ( RIDA ), ^{[ 13 ]} que a su vez consta de la proteína Hda y la pinza deslizante β ( DnaN ) ^{[ 14 ]} y la hidrólisis de DnaA - ATP dependiente de datA . ^{[ 15 ]} La forma ADP se convierte en la forma ATP mediante las secuencias reactivadoras de DnaA 1 y 2 (DARS1 y DARS2). ^{[ 16 ]}

Regulación de la unión de DnaA al ADN en OriC

Dado que la replicación del ADN debe ocurrir de forma irreversible y solo una vez por ciclo, el comportamiento de unión de los complejos DnaA a OriC está altamente regulado y, por lo tanto, depende de muchos otros mecanismos celulares. ^{[ 17 ] [ 18 ]} Si bien todos los sitios OriC se unen al inicio de la replicación, hay tres sitios de unión de alta afinidad (R1, R2 y R4) que suelen estar ocupados por DnaA durante la mayor parte del ciclo celular, lo que hace que su unión dependa menos de otros eventos que ocurren dentro de la célula en un momento dado. ^{[ 4 ] [ 19 ]}  Por el contrario, los sitios de menor afinidad suelen unirse a los complejos DnaA solo justo antes de que comience la replicación. ^{[ 6 ]} Actualmente hay ocho sitios identificados con menor afinidad de unión DnaA/OriC: R5 (o R5M), I1, I2, I3 y R3, tau2, C1, C2 y C3. ^{[ 20 ]} Entre los sitios de alta afinidad R1 y R2 existen los sitios de baja afinidad R5M, tau2, I1 e I2, y C3, C2, 13 y C1 existen entre los sitios R2 y R4. ^{[ 6 ]} Los sitios I, tau2, C2 y C3 se unen preferentemente y son más eficientes en la unión a DnaA en su forma activa unida a ATP (DnaA-ATP) antes de la separación de la hebra de ADN, mientras que los sitios R1-R5 y el sitio C1 no han demostrado una preferencia por la unión con DnaA-ATP sobre DnaA-ADP. ^{[ 21 ]} La unión de OriC con complejos DnaA-ATP activos en los sitios I de menor afinidad, así como en los sitios tau2, C2 y C3, es necesaria para que el proceso de separación de hebras se inicie de manera regulada en el tiempo, lo que significa que DnaA-ATP no puede ser sustituido por complejos DnaA-ADP inactivos para iniciar la replicación correctamente y con suficiente regulación. ^{[ 6 ]} Estudios recientes sugieren que, si bien los sitios OriC unidos completamente a complejos DnaA-ADP son capaces de preparar la célula para la replicación del ADN, tienen dificultades para mantener la regulación de la frecuencia de replicación sana y constante que logran las células que continúan con sitios OriC unidos a complejos DnaA-ATP, lo que tal vez explique por qué algunos sitios se unen preferentemente a la conformación activa de DnaA sobre la conformación inactiva. ^{[ 6 ] [ 21 ]} Otras dos proteínas, una proteína del factor de integración del huésped (IHF) y una proteína asociada al iniciador DnaA (DiaA), ayudan a facilitar la unión de los complejos DnaA-ATP a los sitios OriC y preparan el terreno para que se produzca la iniciación de la replicación. ^{[ 17 ] [ 22 ] [ 23 ]}

IHF desempeña un papel funcional clave al regular positivamente la unión de los complejos DnaA a los sitios OriC de menor afinidad mientras la célula se prepara para la replicación, esencialmente igualando el campo de juego entre los sitios OriC de alta y baja afinidad en términos de su capacidad para unirse con los complejos DnaA. ^{[ 24 ]} Se cree que la unión cooperativa es un mecanismo en el cual los sitios de alta afinidad suministran a los sitios de menor afinidad en su proximidad con complejos DnaA-ATP en los momentos previos al inicio de la replicación. ^{[ 6 ]} Si bien DnaA puede saturar todos los sitios de unión OriC en sistemas que carecen de IHF, se necesita una concentración mucho mayor de DnaA en el entorno celular para que esto se logre. ^{[ 24 ]} Sin embargo, en estas situaciones, las células también experimentan una pérdida de sincronización en su tiempo de inicio de replicación, lo que indica cuán importante es IHF para mantener una regulación consistente de este proceso en las células y prevenir un retraso en el inicio de la replicación. ^{[ 6 ] [ 24 ]} Cuando IHF está presente en un sistema celular, IHF mejora la unión de DnaA a sitios OriC de baja afinidad sin necesidad de aumentar la concentración basal de DnaA presente, lo que resalta aún más su importancia en el mantenimiento del momento de inicio de la replicación. ^{[ 6 ] [ 24 ]}

Conformacionalmente, IHF ayuda a promover el proceso de unión de los complejos DnaA-ATP a los sitios de unión OriC de baja afinidad en el momento adecuado al unirse a un sitio diferente en OriC antes del inicio de la replicación, lo que hace que el ADN se doble de tal manera que facilita la unión eficiente con los complejos DnaA-ATP. ^{[ 19 ] [ 18 ]} Antes de que IHF se una a OriC, una proteína diferente, la proteína factor para estimulación de la inversión (FIS), se une al ADN durante la mayor parte del ciclo celular (con la excepción de los eventos que conducen al inicio de la replicación), inhibiendo la unión de IHF al ADN. ^{[ 19 ] [ 18 ] [ 25 ]} En consecuencia, la unión de los complejos DnaA a los sitios OriC de menor afinidad también se inhibe, por lo tanto, evitando que el proceso de replicación cromosómica comience prematuramente y por lo tanto demostrando cómo FIS regula positivamente el mantenimiento de una progresión consistente del ciclo celular a través de la inhibición. ^{[ 6 ] [ 19 ] [ 18 ] [ 25 ]} A medida que la unión de FIS a OriC se debilita, IHF comienza a unirse a OriC, aumentando así la capacidad de los sitios de baja afinidad para unirse a los complejos DnaA-ATP, simultáneamente con la unión de IHF. ^{[ 18 ]} Se hipotetiza que el cambio de la unión de FIS a la unión de IHF al ADN se produce por la generación de más complejos DnaA-ATP, promovidos por la existencia de los sitios de alta afinidad unidos a DnaA mientras FIS está unido simultáneamente al ADN, que luego son reclutados a la región de alta afinidad y se acumulan, ejerciendo un estrés conformacional sobre el FIS unido (especialmente por acumulación en el sitio R2, ya que es el más cercano al sitio de unión de FIS), deteriorando así su capacidad de unión con el ADN. ^{[ 6 ] [ 18 ]} Como resultado, IHF puede aprovechar el estado debilitado de la unión de FIS para luego unirse a su propio sitio OriC respectivo, lo que provoca que el ADN se doble y esencialmente alinee mejor los complejos DnaA-ATP acumulados con los sitios de unión de baja afinidad, ayudando así a facilitar su unión con DnaA-ATP. ^{[ 18 ]} En ausencia del comportamiento de tipo interruptor que ocurre con la transición de la unión de FIS a IHF al ADN, las células no pueden mantener un control sobre la secuencia de eventos que aseguran que la iniciación de la replicación ocurra tanto de forma irreversible como solo una vez por ciclo celular. ^{[ 6 ]}

DiaA regula positivamente la línea de tiempo de inicio de la replicación al facilitar la unión de complejos DnaA-ATP en sitios OriC. ^{[ 22 ] [ 26 ]} DiaA se une a DnaA en su forma tetramérica (que consta de cuatro protómeros de DiaA (proteínas individuales) unidos entre sí), específicamente al primer dominio de DnaA, en la misma región donde se presume que otra proteína, la helicasa de ADN replicativa (DnaB), se une a DnaA. ^{[ 17 ] [ 26 ]} Debido a su estructura tetramérica, DiaA tiene la capacidad de unirse a múltiples complejos DnaA-ATP a la vez, ya que cada protómero dentro del homotetrámero consta de un sitio de unión DnaA-ATP. ^{[ 26 ]} Esta característica beneficiosa de los tetrámeros de DiaA puede ayudar a promover el comportamiento de unión cooperativa de transferencia de moléculas DnaA-ATP a diferentes sitios en la región OriC del ADN mientras la célula se prepara para someterse a la replicación cromosómica. ^{[ 26 ]} DiaA también regula negativamente el proceso de replicación cromosómica al inhibir la unión de la proteína DnaB, cuya presencia y función son necesarias para la replicación cromosómica, a los complejos DnaA-ATP ensamblados en OriC, lo que ayuda a preservar la secuencia de eventos de regulación inflexible necesaria para un proceso de replicación controlado y previene la iniciación asincrónica dentro del ciclo general. ^{[ 17 ] [ 26 ]} Por lo tanto, en conjunto, IHF y DiaA, junto con las proteínas con las que interactúan en sus respectivos mecanismos de unión, son muy importantes para ayudar a los complejos DnaA-ATP a unirse a todos los sitios de unión identificados en OriC, incluidos los sitios de baja afinidad, de manera oportuna que asegura que la iniciación de la replicación ocurra de manera irreversible y solo una vez durante el ciclo celular. ^{[ 23 ]}

Una vez que se ha producido la iniciación de la replicación y el ADN ha sufrido la separación de las hebras con éxito, comienza un proceso diferente para asegurar que DnaA-ATP no pueda unirse directamente al ADN de nuevo con una proteína que regula negativamente la iniciación de la replicación: el locus de datA-SeqA. ^{[ 17 ] [ 19 ]} Cuando el ADN se desenrolla después de la iniciación, se generan nuevas horquillas de replicación, un proceso que posteriormente lleva a la desunión de los complejos DnaA de los sitios OriC. ^{[ 6 ] [ 27 ]} Los sitios GATC del ADN dentro de OriC y en la región donde existe el promotor dnaA se hemimetilan y, por lo tanto, experimentan una capacidad reducida para funcionar y expresarse de la misma manera que lo harían mientras están metilados. ^{[ 6 ] [ 27 ]} SeqA puede prevenir físicamente que la replicación se reinicie prematuramente al unirse a los sitios GATA hemimetilados en OriC, muchos de los cuales se superponen en cierta medida con un par de los sitios de unión de baja afinidad de DnaA, así como con el sitio de unión de IHF en OriC, protegiendo esencialmente a IHF y DnaA de unirse a OriC. ^{[ 6 ] [ 27 ]} Sin embargo, los sitios de unión de alta afinidad del complejo OriC DnaA no son bloqueados por la unión de SeqA al ADN, lo que explica cómo DnaA permanece unido a los tres sitios de alta afinidad durante la mayor parte de la duración del ciclo. ^{[ 6 ]} Cuando los sitios GATC están unidos a SeqA mientras están hemimetilados, también se limita su capacidad para sintetizar nuevas proteínas DnaA, lo que provoca que la concentración de DnaA dentro de la célula disminuya después de la iniciación. ^{[ 6 ]} Por lo tanto, con estos sitios bloqueados por SeqA, la unión de DnaA-ATP a algunos de los sitios de menor afinidad no es posible por una combinación de razones. ^{[ 6 ] [ 17 ]} En estudios realizados con cepas que carecían de la capacidad de producir SeqA, las células no pudieron iniciar la replicación sincrónicamente una vez por ciclo, reflejando los efectos de lo que sucede cuando las células carecen de IHF. ^{[ 19 ] [ 27 ]} Dado que la unión de los sitios de baja afinidad en OriC es básicamente el evento clave que inicia la replicación y el desenrollamiento del ADN, el bloqueo de SeqA de la unión del complejo DnaA-ATP durante la mayor parte del ciclo celular es vital para mantener las células sanas al mantener un ciclo consistente. ^{[ 27 ]}

Dentro de la proteína DnaA existen cuatro disciplinas. Una comparación inicial de las proteínas de Escherichia coli y Bacillus subtilis condujo al descubrimiento de una estructura esférica, que reveló un extremo N relativamente conservado y un extremo C grande en gran medida conservado, separados por una región mayoritariamente variable. ^{[ 28 ]} Como ejemplo, las proteínas enterobacterianas tienen secuencias N- y C-terminales casi idénticas, sin embargo, se caracterizan por numerosos ajustes, elisiones e inserciones de aminoácidos en las regiones variables. ^{[ 29 ]} Existe un motivo ATPasa de la familia AAA+ y una esfera de unión al ADN independiente en la región C-terminal. Se determinó mediante RMN que la esfera IV de Escherichia coli tenía una estructura cristalina cuando se complejaba con una caja DnaA. Como resultado, se confirmó que la lista de ADN está mediada por una combinación de un motivo hélice-giro-hélice y un círculo introductorio. Cuando se une a ATP, pero no a ADP, DnaA forma una estructura superhelicoidal con cuatro monómeros por vuelta. La estructura de la esfera I se ha determinado a partir de tres especies bacterianas adicionales y Escherichia coli mediante RMN. ^{[ 30 ]}

La investigación sobre mutantes dnaA(Ts) proporcionó la primera prueba de que el gen dnaA está autorregulado. La proteína DnaA se sigue produciendo a temperaturas no permisivas donde está inactiva, pero en algunos mutantes puede reactivarse volviendo a una temperatura propicia para el desarrollo. ^{[ 29 ]} Esta capacidad de iniciación reversible —que fue mayor de lo previsto dado el aumento de masa del cultivo— pudo observarse en ausencia de síntesis de proteínas a la temperatura permisiva y sugirió que la síntesis de la proteína DnaA se desreprimió a la alta temperatura de crecimiento. Estos resultados impulsaron una investigación exhaustiva del mutante dnaA46 en condiciones de desarrollo permisivas, intermedias y no permisivas. ^{[ 31 ]} Los hallazgos del estudio revelaron que, a medida que aumentaba la temperatura de crecimiento, la actividad de la proteína DnaA46 disminuía, lo que conducía a concentraciones de ADN y orígenes progresivamente menores a temperaturas intermedias. Se observó un aumento en la capacidad de iniciación simultáneamente con una disminución en la actividad de la proteína DnaA. Hansen y Rasmussen (1977) argumentaron que la proteína DnaA tenía un efecto positivo en la iniciación de la replicación, ya que se encontraron transcripciones que ingresaban al gen dnaA como resultado de la secuenciación de la región promotora de dnaA y el gen dnaA. ^{[ 31 ]} La región promotora de DnaA tiene nueve sitios GATC dentro de 225 pares de bases, y una secuencia que es similar a y un papel negativo en su propia síntesis según estas observaciones. Dos promotores proporcionan repeticiones (cajas DnaA) en la región oriC se encontró entre los dos promotores. Según varios estudios, la proteína DnaA regula negativamente ambos promotores. En estas investigaciones, se descubrió que la transcripción de dnaA se reguló positivamente de 4 a 5 veces a temperaturas no permisivas en mutantes dnaATs y se reprimió en la misma cantidad cuando la proteína DnaA se sobreprodujo. La autorregulación del gen dnaA requiere la caja DnaA. ^{[ 32 ]} La secuencia de la región promotora de dnaA2p tiene algunas características interesantes que se pueden observar con mayor claridad. Este promotor contiene dos sitios GATC, uno en la secuencia 10 y el otro en la secuencia 35, y tanto in vivo como in vitro, la metilación aumenta la transcripción de este promotor en un factor de dos. Además, la proteína DnaA se une a regiones corriente arriba del promotor de dnaA2p con alta afinidad. ^{[ 11 ]}

• complejo de reconocimiento de origen

• DnaA+proteína,+Bacterias en los Encabezamientos de Materia Médica (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.