Secuenciación

En la secuenciación por terminación de cadena (secuenciación de Sanger), la extensión se inicia en un sitio específico del ADN molde mediante un oligonucleótido corto, denominado "cebador", complementario al molde en esa región. El cebador se extiende utilizando una ADN polimerasa , una enzima que replica el ADN. Junto con el cebador y la ADN polimerasa, se encuentran las cuatro bases desoxinucleotídicas (bloques de construcción del ADN), así como una baja concentración de un nucleótido terminador de cadena (generalmente un dideoxinucleótido ). Los desoxinucleótidos carecen del grupo OH tanto en la posición 2' como en la 3' de la molécula de ribosa; por lo tanto, una vez insertados en una molécula de ADN, impiden su posterior elongación. En este secuenciador se emplean cuatro recipientes diferentes, cada uno con uno solo de los cuatro dideoxirribonucleótidos. La incorporación de los nucleótidos terminadores de cadena por la ADN polimerasa en una posición aleatoria da como resultado una serie de fragmentos de ADN relacionados, de diferentes tamaños, que terminan con un dideoxirribonucleótido determinado. Posteriormente, los fragmentos se separan por tamaño mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida en placa, o más comúnmente en la actualidad, en un tubo de vidrio estrecho (capilar) lleno de un polímero viscoso.

Una alternativa al marcaje del cebador consiste en marcar los terminadores, técnica comúnmente denominada «secuenciación con terminadores de tinte». La principal ventaja de este método es que la secuenciación completa puede realizarse en una sola reacción, en lugar de las cuatro necesarias con el método de marcaje con cebador. Esto se consigue marcando cada uno de los dideoxinucleótidos terminadores de cadena con un colorante fluorescente distinto, que emite fluorescencia a una longitud de onda diferente . Este método es más sencillo y rápido que el de marcaje con cebador, pero puede generar picos de datos más irregulares (con diferentes alturas) debido a una diferencia en la incorporación de los grandes terminadores de cadena, que depende de la plantilla. Este problema se ha reducido significativamente con la introducción de nuevas enzimas y colorantes que minimizan la variabilidad en la incorporación. Este método se utiliza actualmente en la gran mayoría de las reacciones de secuenciación, ya que es más sencillo y económico. La principal razón es que no es necesario marcar los cebadores por separado (lo que puede suponer un gasto considerable para un cebador personalizado de un solo uso), aunque esto no representa un problema con los cebadores «universales» de uso frecuente. Esta situación está cambiando rápidamente debido a la creciente rentabilidad de los sistemas de segunda y tercera generación de Illumina, 454, ABI, Helicos y Dover.

El método de pirosecuenciación se basa en la detección de la liberación de pirofosfato tras la incorporación de nucleótidos. Antes de realizar la pirosecuenciación, la cadena de ADN a secuenciar debe amplificarse mediante PCR. A continuación, se elige el orden en que se añadirán los nucleótidos en el secuenciador (por ejemplo, GATC). Cuando se añade un nucleótido específico, si la ADN polimerasa lo incorpora a la cadena en crecimiento, se libera el pirofosfato, que se convierte en ATP por acción de la ATP sulfurilasa. El ATP impulsa la oxidación de la luciferasa; esta reacción genera una señal luminosa que se registra como un pico en el pirograma. De esta forma, la incorporación de nucleótidos se correlaciona con una señal. La señal luminosa es proporcional a la cantidad de nucleótidos incorporados durante la síntesis de la cadena de ADN (es decir, dos nucleótidos incorporados corresponden a dos picos en el pirograma). Si los nucleótidos añadidos no se incorporan a la molécula de ADN, no se registra ninguna señal; la enzima apirasa elimina cualquier nucleótido no incorporado que quede en la reacción. Este método no requiere ni nucleótidos marcados con fluorescencia ni electroforesis en gel. La pirosecuenciación, desarrollada por Pål Nyrén y Mostafa Ronaghi DNA, ha sido comercializada por Biotage (para secuenciación de bajo rendimiento) y 454 Life Sciences (para secuenciación de alto rendimiento). Esta última plataforma secuencia aproximadamente 100 megabases [ahora hasta 400 megabases] en una ejecución de siete horas con una sola máquina. En el método basado en matrices (comercializado por 454 Life Sciences), el ADN monocatenario se hibrida a microesferas y se amplifica mediante EmPCR . Estas microesferas unidas al ADN se colocan en pocillos de un chip de fibra óptica junto con enzimas que producen luz en presencia de ATP . Cuando los nucleótidos libres se lavan sobre este chip, se produce luz a medida que se genera ATP cuando los nucleótidos se unen con sus pares de bases complementarias . La adición de uno o más nucleótidos produce una reacción que genera una señal luminosa, la cual es registrada por la cámara CCD del instrumento. La intensidad de la señal es proporcional al número de nucleótidos, por ejemplo, a la cantidad de segmentos de homopolímeros, incorporados en un único flujo de nucleótidos.

Si bien los métodos descritos anteriormente ilustran diversas técnicas de secuenciación, se utilizan términos relacionados distintos cuando se secuencia una gran parte del genoma. Se han desarrollado varias plataformas para realizar la secuenciación del exoma (un subconjunto de todo el ADN de todos los cromosomas que codifican genes) o la secuenciación del genoma completo (secuenciación de todo el ADN nuclear humano).