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Secuenciación de microARN

La secuenciación de microARN (miRNA-seq) , un tipo de RNA-Seq , utiliza secuenciación de próxima generación o secuenciación de ADN de alto rendimiento y paralelismo masivo para ...

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La secuenciación de microARN (miRNA-seq) , un tipo de RNA-Seq , utiliza secuenciación de próxima generación o secuenciación de ADN de alto rendimiento y paralelismo masivo para secuenciar microARN , también llamados miRNA. La miRNA-seq se diferencia de otras formas de RNA-seq en que el material de entrada suele estar enriquecido con ARN pequeños. La miRNA-seq permite a los investigadores examinar patrones de expresión específicos de tejidos, asociaciones con enfermedades e isoformas de miRNA, y descubrir miRNA previamente no caracterizados. La evidencia de que los miRNA desregulados desempeñan un papel en enfermedades como el cáncer [ 1 ] ha posicionado a la miRNA-seq como una herramienta potencialmente importante en el futuro para el diagnóstico y el pronóstico, a medida que los costos continúan disminuyendo [ 2 ] . Al igual que otras tecnologías de perfilado de miRNA, la miRNA-seq tiene ventajas (independencia de la secuencia, cobertura) y desventajas (alto costo, requisitos de infraestructura, duración de la ejecución y posibles artefactos ) [ 3 ] .

Introducción

Los microARN (miARN) son una familia de pequeños ácidos ribonucleicos, de 21 a 25 nucleótidos de longitud, que modulan la expresión de proteínas a través de la degradación de transcritos, la inhibición de la traducción o el secuestro de transcritos. [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] El primer miARN que se descubrió, lin-4 , se encontró en un cribado de mutagénesis genética para identificar elementos moleculares que controlan el desarrollo postembrionario del nematodo Caenorhabditis elegans . [ 7 ] El gen lin-4 codificaba un ARN de 22 nucleótidos con sitios de unión complementarios conservados en la región 3' no traducida del transcrito de ARNm lin-14 [ 8 ] y regulaba negativamente la expresión de la proteína LIN-14. [ 9 ] Ahora se cree que los miRNAs están involucrados en la regulación de muchos procesos biológicos y de desarrollo, incluyendo la hematopoyesis ( miR-181 en Mus musculus [ 10 ] ), el metabolismo de los lípidos ( miR-14 en Drosophila melanogaster [ 11 ] ) y el desarrollo neuronal ( lsy-6 en Caenorhabditis elegans [ 12 ] ). [ 6 ] Estos descubrimientos hicieron necesario el desarrollo de técnicas capaces de identificar y caracterizar miRNAs, como miRNA-seq.

Historia

La secuenciación de microARN (miRNA-seq) se desarrolló para aprovechar las tecnologías de secuenciación de próxima generación o de secuenciación masiva en paralelo de alto rendimiento con el fin de encontrar nuevos miRNA y sus perfiles de expresión en una muestra determinada. La secuenciación de miRNA en sí misma no es una idea nueva; los métodos iniciales de secuenciación utilizaban métodos de secuenciación de Sanger . La preparación de la secuenciación implicaba la creación de bibliotecas mediante la clonación de ADN retrotranscrito a partir de pequeños ARN endógenos de 21 a 25 pb seleccionados por electroforesis en columna y en gel . [ 13 ] Sin embargo, este método es exhaustivo en términos de tiempo y recursos, ya que cada clon debe amplificarse y prepararse individualmente para la secuenciación. Este método también favorece inadvertidamente a los miRNA que se expresan en gran medida. [ 6 ] La secuenciación de próxima generación elimina la necesidad de sondas de hibridación específicas de secuencia requeridas en el análisis de microarrays de ADN , así como los laboriosos métodos de clonación requeridos en el método de secuenciación de Sanger. Además, las plataformas de secuenciación de próxima generación en el método miRNA-SEQ facilitan la secuenciación de grandes grupos de ARN pequeños en una sola corrida de secuenciación. [ 14 ]

La secuenciación de miRNA se puede realizar utilizando diversas plataformas de secuenciación. El primer análisis de ARN pequeños mediante métodos de secuenciación de miRNA examinó aproximadamente 1,4 millones de ARN pequeños de la planta modelo Arabidopsis thaliana utilizando la plataforma de secuenciación de firmas masivamente paralela (MPSS) de Lynx Therapeutics . Este estudio demostró el potencial de las nuevas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para el estudio de los ARN pequeños y mostró que los genomas generan grandes cantidades de ARN pequeños, siendo las plantas fuentes particularmente ricas de ARN pequeños. [ 15 ] Estudios posteriores utilizaron otras tecnologías de secuenciación, como un estudio en C. elegans que identificó 18 nuevos genes de miRNA, así como una nueva clase de ARN pequeños de nematodos denominados 21U-RNA . [ 16 ] Otro estudio que comparó los perfiles de ARN pequeños de tumores cervicales humanos y tejido normal, utilizó el analizador de genoma Illumina (empresa) para identificar 64 nuevos genes de miRNA humanos, así como 67 miRNA expresados ​​diferencialmente. [ 17 ] La plataforma de secuenciación SOLiD de Applied Biosystems también se ha utilizado para examinar el valor pronóstico de los miRNA en la detección del cáncer de mama humano. [ 18 ]

Métodos

Preparación de la biblioteca de miRNA

Preparación de ARN pequeño

La construcción de bibliotecas de secuencias puede realizarse utilizando diversos kits, dependiendo de la plataforma de secuenciación de alto rendimiento empleada. Sin embargo, existen varios pasos comunes para la preparación de secuencias de ARN pequeño. [ 19 ] [ 20 ]

Aislamiento de ARN total

En una muestra dada, todo el ARN se extrae y aísla utilizando un método de isotiocianato/fenol/cloroformo (GITC/fenol) o un producto comercial como el reactivo Trizol ( Invitrogen ) . Generalmente se requiere una cantidad inicial de 50-100 μg de ARN total, 1 g de tejido normalmente produce 1 mg de ARN total, para la purificación en gel y la selección de tamaño. [ 20 ] También se mide el control de calidad del ARN, por ejemplo, ejecutando un chip de ARN en Caliper LabChipGX ( Caliper Life Sciences ). 

Fraccionamiento por tamaño de ARN pequeños mediante electroforesis en gel.

El ARN aislado se analiza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. Se utiliza un método de imagen, como oligonucleótidos marcados con 5'-32P radiactivo junto con un marcador de tamaño, para identificar una sección del gel que contiene ARN del tamaño adecuado, reduciendo así la cantidad de material que finalmente se secuencia. Este paso no tiene por qué realizarse necesariamente antes de los pasos de ligación y transcripción inversa que se describen a continuación. [ 19 ] [ 20 ]

Ligadura

El paso de ligación añade adaptadores de ADN a ambos extremos de los ARN pequeños, que actúan como sitios de unión de cebadores durante la transcripción inversa y la amplificación por PCR . Un adaptador de ADN monocatenario adenilado en el extremo 3', seguido de un adaptador en el extremo 5', se liga a los ARN pequeños mediante una enzima ligante como la ARN ligasa 2 de T4. Los adaptadores también están diseñados para capturar ARN pequeños con un grupo fosfato en el extremo 5', característicos de los microARN, en lugar de productos de degradación de ARN con un grupo hidroxilo en el extremo 5'. [ 19 ] [ 20 ]

Transcripción inversa y amplificación por PCR

Este paso convierte los pequeños ARN ligados al adaptador en clones de ADNc utilizados en la reacción de secuenciación. Existen numerosos kits comerciales que realizan este paso mediante algún tipo de transcriptasa inversa . Posteriormente, se lleva a cabo una PCR para amplificar el conjunto de secuencias de ADNc. También se pueden utilizar cebadores diseñados con etiquetas de nucleótidos únicas para crear etiquetas de identificación en la secuenciación multiplex de bibliotecas combinadas. [ 19 ] [ 20 ]

Secuenciación

La secuenciación de ARN real varía significativamente según la plataforma utilizada. Tres plataformas comunes de secuenciación de próxima generación [ 21 ] son ​​la pirosecuenciación en la plataforma 454 Life Sciences , [ 22 ] la secuenciación por síntesis basada en polimerasa en la plataforma Illumina (empresa) , [ 23 ] o la secuenciación por ligación en la plataforma ABI Solid Sequencing . [ 24 ]

Análisis de datos

Un aspecto fundamental del análisis de datos de miRNA-seq es la capacidad de 1) obtener los niveles de abundancia de miRNA a partir de las lecturas de secuencia, 2) descubrir nuevos miRNAs y luego poder 3) determinar los miRNA expresados ​​diferencialmente y sus 4) genes diana de ARNm asociados.

Análisis de datos de miRNA-seq

Alineación de miRNA y cuantificación de su abundancia

Los miRNAs pueden expresarse preferentemente en ciertos tipos de células, tejidos, etapas de desarrollo o en estados patológicos particulares como el cáncer. [ 1 ] Dado que la secuenciación profunda (miRNA-seq) genera millones de lecturas de una muestra dada, nos permite perfilar los miRNAs; ya sea cuantificando su abundancia absoluta o descubriendo sus variantes (conocidas como isomires [ 25 ] ). Tenga en cuenta que, dado que la longitud promedio de las lecturas de secuencia es mayor que la del miRNA promedio (17-25 nt), los extremos 3' y 5' del miRNA deberían encontrarse en la misma lectura. Existen varios algoritmos de cuantificación de abundancia de miRNA. [ 21 ] [ 26 ] Sus pasos generales son los siguientes: [ 27 ]

  1. Tras la secuenciación, las lecturas de secuencia sin procesar se filtran según su calidad. Además, se eliminan las secuencias adaptadoras de dichas lecturas.
  2. Las lecturas resultantes se formatean en un archivo fasta donde se registra el número de copia y la secuencia para cada etiqueta única.
  3. Las secuencias que puedan representar contaminación por E. coli se identifican mediante una búsqueda BLAST en una base de datos de E. coli y se eliminan del análisis.
  4. Cada una de las secuencias restantes se alinea contra una base de datos de secuencias de miRNA (como miRBase [ 28 ] ). Para tener en cuenta el procesamiento imperfecto de DICER , se permite un saliente de 6 nt en el extremo 3' y de 3 nt en el extremo 5'.
  5. Las lecturas que no se alinean con la base de datos de miRNA se alinean de forma aproximada con precursores de miRNA para detectar miRNA que puedan contener mutaciones o que hayan sufrido edición de ARN .
  6. A continuación, el número de lecturas de cada miRNA se normaliza con respecto al número total de miRNAs mapeados para informar sobre la abundancia de cada miRNA.

Descubrimiento de nuevos miRNA

Otra ventaja de la secuenciación de miRNA es que permite el descubrimiento de nuevos miRNAs que podrían haber eludido los métodos tradicionales de cribado y perfilado. [ 27 ] Existen varios algoritmos novedosos para el descubrimiento de miRNAs. Sus pasos generales son los siguientes:

  1. Obtenga lecturas que no se alinearon con secuencias de miRNA conocidas y mapéelas al genoma.
  2. Método de plegamiento del ARN
    1. Para las secuencias de miRNA donde se encuentra una coincidencia exacta, obtenga la secuencia genómica que incluye ~100 pb de secuencia flanqueante a cada lado y procese el ARN a través de un software de plegamiento de ARN como el paquete Vienna. [ 29 ]
    2. Las secuencias plegadas que se encuentran en uno de los brazos de la horquilla de miRNA y que tienen una energía libre mínima de menos de ~25 kcal/mol se preseleccionan como posibles miRNA.
    3. Las secuencias preseleccionadas se reducen para incluir solo la posible secuencia precursora y luego se vuelven a plegar para garantizar que la secuencia precursora no haya sido estabilizada artificialmente por secuencias vecinas.
    4. Las secuencias plegadas resultantes se consideran nuevos miRNAs si la secuencia de miRNA se encuentra dentro de uno de los brazos de la horquilla y están altamente conservadas entre especies.
  3. Método de expresión de cadena estrellada (miRdeep [ 30 ] )
    1. Las secuencias de miRNA novedosas se identifican en función del patrón de expresión característico que presentan debido al procesamiento por DICER: mayor expresión del miRNA maduro que de las secuencias de cadena en estrella y de bucle.

Análisis de expresión diferencial

Una vez cuantificada la abundancia de miRNAs para cada muestra, se pueden comparar sus niveles de expresión entre muestras. De este modo, se podrían identificar los miRNAs que se expresan preferentemente en momentos específicos, o en tejidos o estados patológicos particulares. Tras normalizar el número de lecturas mapeadas entre muestras, se pueden utilizar diversas pruebas estadísticas (como las utilizadas en el perfilado de la expresión génica ) para determinar la expresión diferencial.

Predicción de objetivos

La identificación de los ARNm diana de un miRNA permitirá comprender los genes o redes de genes cuya expresión regulan. [ 31 ] Las bases de datos públicas ofrecen predicciones de los ARNm diana de los miRNA. Sin embargo, para distinguir mejor las predicciones verdaderas positivas de las falsas positivas, los datos de secuenciación de miRNA se pueden integrar con los datos de secuenciación de ARNm para observar pares funcionales miRNA:ARNm. RNA22, [ 32 ] TargetScan , [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] [ 37 ] [ 38 ] miRanda, [ 39 ] y PicTar [ 40 ] son ​​programas diseñados para este propósito. Aquí se presenta una lista de programas de predicción . Los pasos generales son:

  1. Se determinan los pares de unión miRNA:mRNA y se identifica la complementariedad entre las secuencias de miRNA en la región 3'-UTR de la secuencia de mRNA.
  2. Determinar el grado de conservación de los pares de unión miRNA:mRNA entre especies. Por lo general, los pares con mayor afinidad de unión tienen menos probabilidades de ser falsos positivos en la predicción.
  3. Observe si existen indicios de que un miRNA actúa como diana en los datos de secuenciación de ARNm o de expresión proteica: cuando la expresión del miRNA es alta, la expresión génica y proteica de su gen diana debería ser baja.

Validación de objetivos para ARNm escindidos

Muchos miRNA funcionan para dirigir la escisión de sus ARNm diana; esto es particularmente cierto en plantas, y por lo tanto se han desarrollado métodos de secuenciación de alto rendimiento para aprovechar esta propiedad de los miRNA mediante la secuenciación de los extremos 3' sin caperuza de los ARNm escindidos o degradados. Estos métodos se conocen como secuenciación del degradoma o PARE. [ 41 ] [ 42 ] La validación de la escisión diana en ARNm específicos se realiza típicamente utilizando una versión modificada de la amplificación rápida de extremos de ADNc 5' con un cebador específico del gen.

Aplicaciones

Identificación de nuevos miRNAs

La secuenciación de miRNA ha revelado nuevos miRNAs que antes pasaban desapercibidos en los métodos tradicionales de perfilado de miRNA. Ejemplos de estos hallazgos se encuentran en células madre embrionarias, [ 25 ] embriones de pollo, [ 43 ] leucemia linfoblástica aguda, [ 44 ] linfoma difuso de células B grandes y células B, [ 45 ] leucemia mieloide aguda , [ 46 ] y cáncer de pulmón. [ 47 ]

biomarcadores de enfermedades

Los microARN son reguladores importantes de casi todos los procesos celulares, como la supervivencia, la proliferación y la diferenciación . Por consiguiente, no es de extrañar que los microARN estén implicados en diversos aspectos del cáncer mediante la regulación de la expresión de genes supresores de tumores y oncogenes . En combinación con el desarrollo de métodos de perfilado de alto rendimiento, los microARN se han identificado como biomarcadores para la clasificación del cáncer, la respuesta a la terapia y el pronóstico. [ 48 ] Además, dado que los microARN regulan la expresión génica, también pueden revelar perturbaciones en redes reguladoras importantes que podrían estar impulsando un trastorno particular. [ 48 ] A continuación se presentan varias aplicaciones de los microARN como biomarcadores y predictores de enfermedades.

α Esta no es una lista exhaustiva de los miRNAs involucrados con estas neoplasias malignas.

Comparación con otros métodos de perfilado de miRNA

Las desventajas de usar miRNA-seq en comparación con otros métodos de perfilado de miRNA son que es más costoso, generalmente requiere una mayor cantidad de ARN total, implica una amplificación extensa y consume más tiempo que los métodos de microarrays y qPCR. [ 3 ] Además, los métodos de preparación de bibliotecas de miRNA-seq parecen tener una representación preferencial sistemática del complemento de miRNA, lo que impide la determinación precisa de la abundancia de miRNA. [ 64 ] Al mismo tiempo, el enfoque es independiente de la hibridación y, por lo tanto, no requiere información de secuencia a priori . Debido a esto, se pueden obtener secuencias de nuevos miRNAs e isoformas de miRNA (isoMirs), distinguir miRNAs secuencialmente similares e identificar mutaciones puntuales . [ 65 ]

Comparación de plataformas para el perfilado de miRNA

[ 3 ]

Referencias

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