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Prueba de flujo lateral

Ilustración de la NASA de un ensayo de flujo lateral Una prueba de flujo lateral ( PFL ), [ 1 ] es un ensayo también conocido como prueba inmunocromatográfica de flujo lateral (...

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Ilustración de la NASA de un ensayo de flujo lateral

Una prueba de flujo lateral ( PFL ), [ 1 ] es un ensayo también conocido como prueba inmunocromatográfica de flujo lateral (PIC) . Es un dispositivo sencillo diseñado para detectar la presencia de una sustancia objetivo en una muestra líquida sin necesidad de equipos especializados y costosos. Las PFL se utilizan ampliamente en el diagnóstico médico en el hogar, en el punto de atención y en el laboratorio. Por ejemplo, la prueba de embarazo casera es una PFL que detecta una hormona específica. Estas pruebas son sencillas y económicas, y generalmente muestran resultados en aproximadamente cinco a treinta minutos. [ 2 ] Muchas aplicaciones de laboratorio aumentan la sensibilidad de las PFL sencillas mediante el uso de equipos adicionales específicos. [ 3 ] Muchas PFL se denominan pruebas de diagnóstico rápido (PDR), aunque este término también incluye otros formatos, como las pruebas de flujo vertical. [ 4 ]

Las pruebas de función hepática (PFH) funcionan según los mismos principios de cromatografía de afinidad que los ensayos inmunoenzimáticos ( ELISA ). En esencia, estas pruebas hacen pasar la muestra líquida por la superficie de una almohadilla con moléculas reactivas que muestran un resultado visual positivo o negativo. Las almohadillas se basan en una serie de lechos capilares, como trozos de papel poroso, [ 5 ] polímero microestructurado [ 6 ] [ 7 ] o polímero sinterizado . [ 8 ] Cada una de estas almohadillas tiene la capacidad de transportar fluidos ( p. ej., orina, sangre, saliva) de forma espontánea. [ 9 ]

La almohadilla de muestra actúa como una esponja y retiene el exceso de líquido de la muestra. Una vez empapado, el líquido fluye hacia la segunda almohadilla de conjugado, donde el fabricante ha almacenado partículas bioactivas liofilizadas llamadas conjugados (véase más abajo) en una matriz de sal y azúcar. La almohadilla de conjugado contiene todos los reactivos necesarios para una reacción química optimizada entre la molécula objetivo (p. ej., un antígeno ) y su pareja química (p. ej., un anticuerpo ) inmovilizada en la superficie de la partícula. Esto marca las partículas objetivo a medida que pasan por la almohadilla y continúan hacia las líneas de prueba y control. La línea de prueba muestra una señal, a menudo un color, como en las pruebas de embarazo. La línea de control contiene ligandos de afinidad que indican si la muestra ha pasado y si las biomoléculas en la almohadilla de conjugado están activas. Después de pasar por estas zonas de reacción, el líquido entra en el material poroso final, la mecha, que simplemente actúa como contenedor de residuos.

Las pruebas de flujo lateral pueden funcionar como ensayos competitivos o tipo sándwich . Dado que la sustancia objetivo suele ser un antígeno biológico , muchas pruebas de flujo lateral son pruebas rápidas de antígenos (RAT o ART).

Historia

Las LFT se derivan de la cromatografía en papel , que fue desarrollada en 1943 por Martin y Synge , [ 10 ] y perfeccionada en 1944 por Consden, Gordon y Martin. [ 11 ] [ 12 ] Hubo una explosión de actividad en este campo después de 1945. [ 10 ] La tecnología ELISA se desarrolló en 1971. [ 13 ] Un conjunto de patentes de LFT, incluida la US 6,485,982 litigada  que se describe a continuación, fueron presentadas por Armkel LLC a partir de 1988. [ 14 ]

El primer dispositivo de flujo lateral disponible comercialmente fue el Clearblue One Step de Unipath en 1988. Este producto combinaba la tecnología de anticuerpos monoclonales emparejados (patentada en 1980 por el profesor Philip Porter de Unipath y sus colegas, entre ellos Paul Davis y Keith May) y el producto Clearblue original lanzado en junio de 1985. [ 15 ]

Sinopsis

Partículas coloreadas

En principio, se puede utilizar cualquier partícula de color, pero las más comunes son las de látex (azul) o las nanopartículas de oro (rojo) [ 16 ] . El color rojo de las partículas de oro se debe a la resonancia de plasmones de superficie localizada [ 17 ] . También se pueden utilizar partículas marcadas con fluorescencia [ 18 ] o magnetismo [ 19 ] [ 20 ] , pero estas requieren el uso de un lector electrónico para evaluar el resultado de la prueba.

Mecanismos

Ensayos tipo sándwich

Diferencia entre los formatos de ensayo tipo sándwich y ensayo competitivo de las pruebas de flujo lateral.

Los ensayos tipo sándwich se utilizan generalmente para analitos (antígenos) de mayor tamaño, ya que tienden a tener múltiples sitios de unión. [ 21 ] A medida que la muestra migra a través del ensayo, primero encuentra un conjugado, que es un anticuerpo específico para el analito objetivo marcado con una etiqueta visual, generalmente oro coloidal. Los anticuerpos se unen al analito objetivo dentro de la muestra y migran juntos hasta llegar a la línea de prueba. La línea de prueba también contiene anticuerpos inmovilizados específicos para el analito objetivo, que se unen a las moléculas del conjugado unidas al analito migrado. La línea de prueba presenta entonces un cambio visual debido a la concentración de la etiqueta visual, lo que confirma la presencia de las moléculas objetivo. La mayoría de los ensayos tipo sándwich también tienen una línea de control que aparece independientemente de la presencia del analito objetivo para asegurar el correcto funcionamiento de la almohadilla de flujo lateral. [ 2 ]

El ensayo rápido y económico basado en la técnica del sándwich se utiliza habitualmente en las pruebas de embarazo caseras que detectan la gonadotropina coriónica humana (hCG) en la orina de las mujeres embarazadas.

Ensayos competitivos

Los ensayos competitivos se utilizan generalmente para analitos más pequeños, ya que estos tienen menos sitios de unión. [ 21 ] La muestra entra en contacto primero con anticuerpos contra el analito diana marcados con una etiqueta visual (partículas coloreadas). La línea de prueba contiene el analito diana fijado a la superficie. Cuando el analito diana está ausente de la muestra, los anticuerpos no unidos se unen a estas moléculas de analito fijadas, lo que significa que se mostrará un marcador visual. Por el contrario, cuando el analito diana está presente en la muestra, se une a los anticuerpos para impedir que se unan al analito fijado en la línea de prueba, por lo que no se muestra ningún marcador visual. Esto difiere de los ensayos tipo sándwich, ya que la ausencia de banda significa que el analito está presente. [ 2 ] [ 21 ]

Mecanismos de unión alternativos

El principio LFT funciona con cualquier conjunto de moléculas que se unan entre sí con alta afinidad , siempre que algunas de ellas puedan inmovilizarse en las nanopartículas de oro y en la línea de prueba, respectivamente. Por ejemplo:

  • Una prueba LFT tipo sándwich que busca anticuerpos reactivos contra un antígeno determinado se realiza reemplazando el anticuerpo en la línea de prueba y las partículas de color con el antígeno objetivo. [ 22 ]
  • Una prueba LFT tipo sándwich que busca ácidos nucleicos conjugados con biotina y digoxigenina (DIG) utiliza anticuerpos anti-DIG en la nanopartícula de oro y estreptavidina en la línea de prueba. [ 22 ]
  • Una prueba LFT tipo sándwich que busca la proteína de la espícula del SARS-CoV-2 utiliza nanocuerpos de llama anti-espícula en la nanopartícula de oro, ACE2 en la línea de prueba y anticuerpos anti-llama en la línea de control. [ 23 ]

Línea de control

La línea de control de esta prueba de embarazo está en blanco, lo que invalida la prueba.

La mayoría de las pruebas incorporan una segunda línea que contiene un anticuerpo adicional (no específico para el analito) que se une a algunas de las partículas coloreadas restantes que no se unieron a la línea de prueba. Esto confirma que el fluido ha pasado correctamente desde la almohadilla de aplicación de la muestra, más allá de la línea de prueba. [ 2 ] Al confirmar que la muestra ha tenido la oportunidad de interactuar con la línea de prueba, se aumenta la confianza en que una línea de prueba visiblemente inalterada puede interpretarse como un resultado negativo (o que una línea de prueba alterada puede interpretarse como un resultado negativo en un ensayo competitivo).

Extracción de plasma sanguíneo

Debido a que el intenso color rojo de la hemoglobina interfiere con la lectura de las pruebas diagnósticas basadas en detección colorimétrica u óptica, la separación del plasma sanguíneo es un primer paso común para aumentar la precisión de las pruebas diagnósticas. El plasma se puede extraer de la sangre total mediante filtros integrados [ 24 ] o mediante aglutinación [ 25 ] .

Velocidad y simplicidad

El tiempo de obtención del resultado de la prueba es un factor clave para estos productos. Los resultados pueden estar disponibles en tan solo unos minutos. Generalmente, existe una relación inversa entre tiempo y sensibilidad: las pruebas más sensibles pueden tardar más en desarrollarse. Otra ventaja importante de este formato de prueba, en comparación con otros inmunoensayos, es su simplicidad, ya que normalmente requiere poca o ninguna preparación de la muestra o los reactivos . [ 26 ]

Pruebas cuantitativas

Lector de pruebas de flujo lateral utilizado para la interpretación digital de tiras reactivas.

La mayoría de las pruebas de flujo lateral (PFL) están diseñadas para funcionar de forma puramente cualitativa. Sin embargo, es posible medir la intensidad de la línea de prueba para determinar la cantidad de analito en la muestra. Varias empresas utilizan dispositivos de diagnóstico portátiles conocidos como lectores de flujo lateral para proporcionar un resultado de ensayo totalmente cuantitativo. Mediante el uso de longitudes de onda de luz únicas para la iluminación, junto con la tecnología de detección CMOS o CCD , se puede producir una imagen rica en señal de las líneas de prueba. Utilizando algoritmos de procesamiento de imágenes diseñados específicamente para un tipo de prueba y medio en particular, las intensidades de las líneas se pueden correlacionar con las concentraciones de analito. Una de estas plataformas de dispositivos portátiles de flujo lateral es fabricada por Detekt Biomedical LLC [ 27 ].

También existen técnicas alternativas no ópticas que permiten obtener resultados de ensayos cuantitativos. Un ejemplo de ello es el inmunoensayo magnético (MIA) en formato LFT, que también permite obtener un resultado cuantificado. Reducir las variaciones en el bombeo capilar del fluido de la muestra es otro método para pasar de resultados cualitativos a cuantitativos. Trabajos recientes han demostrado, por ejemplo, el bombeo capilar con un caudal constante , independientemente de la viscosidad del líquido y la energía superficial . [ 7 ] [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ]

Patentes

Esta es un área altamente competitiva y varias personas reclaman patentes en el campo, en particular Alere (anteriormente Inverness Medical Innovations, ahora propiedad de Abbott ) que posee patentes [ 14 ] originalmente presentadas por Unipath . La  patente estadounidense 6,485,982, que ha sido objeto de litigio, expiró en 2019. Varias otras empresas también poseen patentes en este ámbito. Un grupo de competidores está impugnando la validez de las patentes. [ 31 ] La patente original es aparentemente de 1988. [ 32 ] [ 33 ]

Aplicaciones

Los ensayos de flujo lateral tienen una amplia gama de aplicaciones y permiten analizar diversas muestras, como orina, sangre, saliva, sudor, suero y otros fluidos. Actualmente se utilizan en laboratorios clínicos, hospitales, consultorios médicos y veterinarios, laboratorios de análisis de alimentos e instalaciones de análisis ambiental.

La inmediatez en la obtención de resultados suele ser el factor clave para elegir esta técnica, aunque la simplicidad y la ausencia de necesidad de equipos especializados también son factores importantes. Estas características permiten que las pruebas rápidas se utilicen tanto en el hogar como en farmacias. Gracias a su excepcional calidad, también se utilizan de forma rutinaria en laboratorios bien equipados cuando la demanda es baja.

Las amplias aplicaciones de las pruebas rápidas se deben a su simplicidad y a la alta calidad de sus resultados analíticos. La sensibilidad y especificidad de estas técnicas suelen ser comparables a las de otros métodos más complejos, e incluso, en ocasiones, significativamente mejores. [ 34 ]

Otros usos de los ensayos de flujo lateral son la seguridad alimentaria y ambiental y la medicina veterinaria para sustancias químicas como enfermedades y toxinas. [ 2 ] Las pruebas de flujo lateral también se utilizan comúnmente para la identificación de enfermedades como el ébola, pero las más comunes son las pruebas de embarazo caseras [ 2 ] y las pruebas de SARS-CoV-2.

Enfermedades infecciosas

Las pruebas de función hepática (PFH) que detectan enfermedades infecciosas pueden analizar el antígeno (moléculas del propio patógeno) y/o el anticuerpo (la respuesta defensiva del cuerpo humano a los antígenos). [ 22 ] La elección de cuál analizar depende de la enfermedad específica. Por ejemplo, las pruebas de VIH generalmente buscan el anticuerpo, ya que los niveles del antígeno p24 inmunorreactivo disminuyen a medida que avanza la infección, mientras que el nivel de anticuerpos se mantiene alto. El antígeno p24 sigue siendo valioso para reducir el período ventana , ya que aparece en niveles detectables en la sangre antes que los anticuerpos. [ 35 ] Como resultado, existen pruebas combinadas disponibles para el VIH. [ 36 ]

Se han desarrollado pruebas de función hepática que detectan ácidos nucleicos, pero aún son demasiado nuevas para tener un uso generalizado. [ 22 ]

pruebas de COVID-19

Prueba rápida de antígeno de flujo lateral para COVID-19 con resultado negativo

Los ensayos de flujo lateral han desempeñado un papel fundamental en las pruebas de COVID-19, ya que ofrecen la ventaja de proporcionar un resultado en 15-30 minutos. [ 37 ] La evaluación sistemática de los ensayos de flujo lateral durante la pandemia de COVID-19 [ 38 ] se inició en la Universidad de Oxford como parte de una colaboración del Reino Unido con Public Health England . Un estudio que comenzó en junio de 2020 en el Reino Unido, FALCON-C19, confirmó la sensibilidad de algunos dispositivos de flujo lateral (LFD) en este contexto. [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ] Cuatro de los 64 LFD probados tenían características de rendimiento deseables según estas pruebas iniciales; la prueba cualitativa rápida de antígeno SARS-CoV-2 de Innova tuvo un rendimiento moderado [ 41 ] en la detección/sensibilidad del antígeno viral con una especificidad excelente, aunque las tasas de fallo del kit y el impacto de la capacitación fueron problemas potenciales. [ 40 ] La especificidad de la prueba de Innova es más conocida, pero la sensibilidad en los ensayos de fase 4 fue del 50,1 %. [ 42 ] Esto describe un dispositivo para el cual uno de cada dos pacientes infectados con COVID-19 y examinados en condiciones reales recibiría un resultado falso negativo . Después del cierre de las escuelas en enero de 2021, se introdujeron pruebas de función hepática quincenales en Inglaterra para maestros, alumnos y hogares de alumnos cuando las escuelas reabrieron el 8 de marzo de 2021 para pruebas asintomáticas. [ 43 ] Las pruebas de función hepática quincenales se pusieron a disposición de todos en Inglaterra el 9 de abril de 2021. [ 44 ] Las pruebas de función hepática se han utilizado para pruebas masivas de COVID-19 a nivel mundial [ 45 ] [ 46 ] [ 47 ] y complementan otras medidas de salud pública para COVID-19. [ 48 ]

A finales de 2020, algunos científicos ajenos al gobierno expresaron serias dudas sobre el uso de las pruebas Innova LFD para la detección de la COVID-19. Según Jon Deeks , profesor de bioestadística en la Universidad de Birmingham , Inglaterra, la prueba Innova es «totalmente inadecuada» para la detección en la comunidad: «dado que la prueba puede pasar por alto hasta la mitad de los casos, un resultado negativo indica un riesgo reducido de COVID-19, pero no la descarta». [ 49 ] [ 50 ]

La sensibilidad de las pruebas de función hepática (PFH) de antígeno utilizadas en 2022 fue de alrededor del 70 % cuando se utilizó la prueba de PCR en tiempo real como referencia. Las PFH funcionan mejor en pacientes sintomáticos que en asintomáticos, lo que sugiere que la cantidad de virus presente puede ser demasiado baja para ser detectada por las PFH en muchos de los casos falsos negativos. La especificidad fue bastante alta, del 99 %. [ 51 ] En general, se acepta que las PFH de antígeno tienen un límite de detección (LD) más alto que la PCR. [ 22 ]

Moléculas pequeñas

Ejemplo de un dispositivo de flujo lateral utilizado para analizar la orina en busca de drogas. No se observa ninguna línea en la zona de las benzodiazepinas , lo que indica un resultado positivo para esta clase de fármacos. Las demás drogas y el control negativo (etiquetado como "C") dan negativo.

Los ensayos de flujo lateral competitivos se utilizan comúnmente para pruebas rápidas de detección de drogas mediante orina o saliva. En las pruebas en el lugar de trabajo, un resultado negativo generalmente se interpreta como negativo, mientras que un resultado "positivo" se interpreta como la necesidad de realizar pruebas de laboratorio confirmatorias adicionales para descartar falsos positivos. [ 52 ]

Biomarcadores

También se han desarrollado ensayos de flujo lateral para biomarcadores como los niveles de una determinada proteína en sangre u orina. La prueba de HCG (embarazo) es un ejemplo.

Si la molécula que se analiza está presente en personas sanas en un nivel bajo, el ensayo debe tener un límite de detección (LoD) lo suficientemente alto como para no dar positivo para el nivel de referencia sano. [ 53 ] Un ejemplo es la prueba de función hepática (PFH) de troponina I cardíaca (cTnI) en sangre, que se presenta en variantes cualitativas (cTnI  >  0,5 ng/L) [ 54 ] y cuantitativas. Las PFH de cTnI no son tan sensibles como una prueba de laboratorio típica, pero son suficientes para confirmar casos graves mucho más rápido que una prueba de laboratorio. [ 55 ] Otro ejemplo es la PFH para la relación sFlt1/PlGF, un biomarcador predictivo de preeclampsia . [ 56 ]

Véase también

Referencias

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Lecturas adicionales

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  • Porex Clinical Sciences (fabricante) "Recogida y transporte de muestras | Preparación de muestras | Análisis de muestras" .
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