KaiB

Los ritmos circadianos —oscilaciones endógenas y sincronizables en los procesos biológicos con periodos que se corresponden aproximadamente con las 24 horas del día— se creían antiguamente una propiedad exclusiva de los organismos eucariotas. Se pensaba que los procariotas carecían de la complejidad celular necesaria para mantener una sincronización temporal persistente y compensada por la temperatura. Además, la ampliamente aceptada «regla circadiana- infradiana » estipulaba que las funciones celulares solo podían acoplarse a un oscilador circadiano en células que se dividían únicamente una vez en un periodo de 24 horas. Los procariotas, que a menudo se dividen varias veces al día, no cumplían esta condición. ^{[ 1 ]}

Con el tiempo, la creciente evidencia comenzó a desafiar esta afirmación y apoyó la existencia de un ritmo circadiano bacteriano . Por ejemplo, la separación temporal discreta de la fotosíntesis y la fijación de nitrógeno observada en cianobacterias sugirió la existencia de algún mecanismo de control circadiano. ^{[ 2 ]} Finalmente, en 1986 Tan-Chi Huang y sus colegas descubrieron y caracterizaron ritmos robustos de 24 horas de fijación de nitrógeno en cianobacterias Synechococcus , demostrando ritmicidad circadiana en una especie procariota. ^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]} Tras estos descubrimientos, los cronobiólogos se propusieron identificar los mecanismos moleculares que rigen el funcionamiento del reloj de las cianobacterias.

Takao Kondo , Masahiro Ishiura, Susan Golden , Carl Johnson y sus colegas utilizaron luciferasa bacteriana , un reportero de expresión génica , en el gen psbAI para monitorear la actividad de este gen reloj encontrado en la cianobacteria Synechococcus . La transformación de un mutante reloj de período largo de 44 horas, C44a , con una biblioteca de ADN genómico de tipo silvestre (WT) en un vector plasmídico permitió probar "clones de rescate" con un período normal de 25 horas. Cuando la biblioteca de ADN de este clon rescatado se colocó en un plásmido en el sitio original, se encontró que C44a fue rescatado por completo. Se encontró que un solo grupo de genes, kaiABC , era de naturaleza rítmica cuando se secuenció el fragmento del plásmido responsable del rescate. kaiABC está compuesto por tres genes individuales: kaiA , kaiB y kaiC . El examen de los patrones de rescate en más de 50 mutantes del reloj que mostraban períodos cortos, períodos largos o arritmia reveló la restauración al fenotipo WT en todos los mutantes. La secuenciación posterior reveló un total de 19 mutantes específicos de kaiABC , 14 de los cuales tenían mutaciones en kaiC , 3 en kaiA y 2 en kaiB . ^{[ 6 ]} El hecho de que los fenotipos mutantes fueran causados ​​por una única sustitución de aminoácido en uno de los genes mencionados anteriormente determinó que las proteínas Kai desempeñan un papel significativo en el reloj circadiano de Synechococcus .

Inicialmente, se pensó que un bucle de retroalimentación transcripción-traducción era necesario para crear ritmos circadianos, por lo que se creyó que kaiABC también tendría esta función. Sin embargo, posteriormente se descubrió que la inhibición de la acumulación de ARNm de kaiBC mediante un inhibidor de la transcripción o la traducción no impedía el ciclo circadiano de la fosforilación de kaiC. Por lo tanto, la ritmicidad del reloj de las cianobacterias es independiente tanto de la transcripción como de la traducción. ^{[ 7 ]} Además, se realizaron experimentos para probar la oscilación autosostenible de la fosforilación de KaiC, que es importante en la regulación del grupo de genes kaiABC . Al incubar KaiC junto con KaiA y KaiB, así como ATP, se demostró el aspecto de compensación de temperatura del reloj KaiABC. Además, dichos períodos circadianos observados en mutantes kaiC in vivo también se observaron en cepas in vitro . ^{[ 8 ]}

El oscilador circadiano central de las cianobacterias, codificado por los genes kaiA , kaiB y kaiC , regula los patrones globales de expresión génica y controla procesos celulares esenciales como la fotosíntesis y la división celular. Los ritmos cíclicos y secuenciales de fosforilación y desfosforilación de KaiC constituyen el mecanismo de cronometraje del oscilador, tanto in vivo como in vitro .

KaiC está organizado como un homohexámero en forma de anillo. Cada monómero contiene cuatro motivos estructurales esenciales: un dominio CI, un dominio CII, un dominio de unión al bucle B y una cola que sobresale del extremo C, conocida como bucle A. Debido a que los dominios CI y CII están alineados en el hexámero KaiC, se les denomina colectivamente anillos CI y CII. ^{[ 14 ]} KaiC posee actividad autocinasa y autofosforiladora intrínseca, cada una de las cuales puede ser modulada por la unión de KaiA y KaiB. En particular, la fosforilación y desfosforilación de los residuos Ser431 y Thr432 en el anillo CII impulsan los ritmos circadianos en el oscilador Kai. ^{[ 15 ]}

Al comienzo del día subjetivo, los residuos Ser431 y Thr432 del hexámero KaiC no están fosforilados, y los dominios del bucle A de sus monómeros constituyentes están expuestos. KaiA se une al dominio del bucle A de KaiC, promoviendo la actividad autocinasa. La fosforilación de la proteína ocurre de manera ordenada y secuencial: Thr432 se fosforila primero, seguido de Ser431. La fosforilación del residuo Ser431 induce un cambio conformacional significativo en el hexámero KaiC. Los anillos CI y CII del complejo proteico se apilan más estrechamente, exponiendo el bucle B previamente ocluido. El bucle B, a su vez, recluta a KaiB, que se une simultáneamente a KaiA y KaiC. La unión de KaiB elimina a KaiA del bucle A, lo que a su vez promueve la actividad autofosfatasa de KaiC e inhibe su actividad autocinasa. La desfosforilación de KaiC ocurre en la noche subjetiva y procede en el orden inverso de la fosforilación; Thr432 se desfosforila antes que Ser431. ^{[ 10 ]}

En definitiva, estos ritmos circadianos en la fosforilación de KaiC, regulados por la unión de KaiA y KaiB, crean un oscilador postraduccional que puede interactuar tanto con las vías de entrada para sincronizarse con las condiciones ambientales cambiantes como con las vías de salida para mediar en los eventos transcripcionales.

Aunque el oscilador Kai es capaz de generar ritmos endógenos en la fosforilación, no influye directamente en la expresión génica; ninguna de las proteínas Kai posee dominios de unión al ADN. En cambio, un sistema de dos componentes, formado por SasA (una histidina quinasa ) y RpaA (un factor de transcripción), conecta los cambios en la fosforilación de KaiC con los eventos transcripcionales.

SasA puede unirse al bucle B expuesto de la molécula KaiC tras la fosforilación del residuo Ser431. Esta interacción induce la autofosforilación de SasA y la posterior transferencia de fosfato a RpaA. La RpaA fosforilada activa la expresión de los genes con pico de expresión al anochecer (Clase 1) y reprime la expresión de los genes con pico de expresión al amanecer (Clase 2). Por el contrario, la RpaA no fosforilada reprime la expresión de los genes de Clase 1. Como resultado, la fosforilación rítmica del factor de transcripción, impulsada por el oscilador Kai y la actividad de SasA asociada, produce patrones rítmicos en la expresión génica. ^{[ 16 ]}

KaiB actúa como un regulador principal de la vía SasA-RpaA y presenta adaptaciones estructurales que contribuyen a la generación del ritmo circadiano y facilitan la interacción con SasA y KaiC. La mayor parte de KaiB expresada en cianobacterias existe como un homotetrámero inactivo, incapaz de interactuar con KaiC. El tetrámero de KaiB existe en equilibrio con una forma monomérica de la proteína. Sin embargo, el KaiB monomérico debe sufrir un cambio radical en su estructura terciaria para asociarse con KaiC, pasando de una conformación denominada estado fundamental (gs-KaiB) a una conformación con cambio de plegamiento (fs-KaiB) capaz de unirse al bucle B de KaiC. Hasta la fecha, KaiB es la única proteína de reloj metamórfica conocida, una clase de proteínas capaces de cambiar de plegamiento de forma reversible. ^{[ 10 ]}

Fs-KaiB tiene un plegamiento similar a la tiorredoxina que se asemeja mucho al extremo N-terminal de SasA, y desplaza competitivamente la unión de la quinasa a KaiC. Sin embargo, el cambio conformacional de gs-KaiB a fs-KaiB ocurre lentamente, lo que permite la unión de SasA a KaiC y la activación posterior de RpaA desde el mediodía, cuando el bucle B se expone por primera vez, hasta el anochecer. ^{[ 17 ]} Como resultado, la fosfo-RpaA se acumula a medida que avanza el día y alcanza su pico cerca del anochecer, sincronizando adecuadamente los aumentos en la expresión de los genes de Clase 1. Además, este retraso en la unión de KaiB retrasa el inicio de la actividad autofosfatasa en KaiC, contribuyendo al período circadiano del oscilador cianobacteriano.

Si bien la ritmicidad en el oscilador KaiABC puede reconstituirse in vitro , el reloj está sujeto a varios niveles adicionales de regulación in vivo . Por ejemplo, debe mantenerse una proporción estequiométrica de los componentes del reloj para preservar la ritmicidad. ^{[ 18 ]} kaiB y kaiC , cuyos niveles de transcripción y proteína oscilan considerablemente a lo largo del día, constituyen un operón bajo el control de un único promotor y se transcriben como un ARNm policistrónico. Por el contrario, los niveles de proteína de KaiA, que se encuentra bajo el control de un promotor independiente, permanecen bastante estables durante un período de 24 horas. ^{[ 10 ] [ 19 ]}

Además, la fase del oscilador Kai puede cambiar en respuesta a cambios ambientales. Sin embargo, a diferencia de los mecanismos de cambio de fase caracterizados en organismos eucariotas, los fotopigmentos no parecen desempeñar un papel en el arrastre del reloj cianobacteriano. En cambio, los mecanismos de entrada identificados dependen de cambios bioquímicos que rastrean las reacciones fotosintéticas realizadas por la cianobacteria, reacciones que exhiben aumentos de velocidad proporcionales a la intensidad de la luz ambiental. CikA y LdpA, por ejemplo, detectan el estado redox del entorno intracelular y transmiten los cambios al oscilador Kai. ^{[ 20 ]} Además, KaiA y KaiC parecen detectar directamente metabolitos de la fotosíntesis, específicamente quinona y ATP , y ajustar la fase del oscilador en consecuencia. ^{[ 20 ] [ 21 ]} Hasta la fecha, KaiB no ha sido implicado en una vía de entrada capaz de arrastrar el reloj cianobacteriano.