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La microscopía electrónica inmune (más comúnmente llamada inmunomicroscopía electrónica ) es el equivalente de la inmunofluorescencia , pero utiliza microscopía electrónica en lugar de microscopía óptica . [ 1 ] La inmunomicroscopía electrónica identifica y localiza una molécula de interés, específicamente una proteína de interés, uniéndola a un anticuerpo particular . Esta unión puede formarse antes o después de la inclusión de las células en portaobjetos. Se produce una reacción entre el antígeno y el anticuerpo, lo que hace que esta marca sea visible bajo el microscopio. La microscopía electrónica de barrido es una opción viable si el antígeno se encuentra en la superficie de la célula, pero puede ser necesaria la microscopía electrónica de transmisión para ver la marca si el antígeno se encuentra dentro de la célula. [ 2 ]
Proceso
Los antígenos y sus respectivos anticuerpos (generalmente dos) interactúan en la sección. [ 1 ] La microscopía electrónica de transmisión detecta el anticuerpo y, por lo tanto, la proteína. El segundo anticuerpo suele estar unido al oro, ya que este tiene un número atómico elevado , lo que lo hace muy denso. Las partículas de oro coloidal hacen visibles los anticuerpos al conjugarse con ellos, dado que se conoce su diámetro exacto. [ 3 ] Cuando los electrones atraviesan el microscopio, chocan con esta partícula de oro. El denso átomo de oro refleja los electrones emitidos por el microscopio electrónico y provoca la aparición de la partícula objetivo dentro de la muestra. [ 1 ]
Otro posible proceso implica la proteína A , que se deriva de una bacteria . Esta recubre permanentemente el átomo de oro y se une a la región constante de los anticuerpos. Este proceso utiliza la proteína A como sustituto del anticuerpo secundario y, por consiguiente, solo requiere un anticuerpo. La proteína A hace visible la proteína diana. De este modo, todo el proceso da como resultado la localización y visualización de la proteína diana. [ 1 ]
Al utilizar la inmunomicroscopía electrónica, la muestra puede estar en secciones delgadas para que los electrones puedan penetrarla o teñida negativamente. La tinción negativa ofrece mayor resolución, pero solo permite identificar moléculas que serían reconocibles si estuvieran aisladas. En la inmunomicroscopía electrónica, la tinción negativa consiste en implantar una pequeña partícula en la muestra, lo que permite una mejor resolución de las estructuras internas. La ventaja de la inmunomicroscopía electrónica radica en que permite la identificación de partículas independientemente del contexto. [ 4 ]
Complicaciones y resultados
Posibles complicaciones
Las secciones que se observan al microscopio deben ser muy delgadas para permitir el paso de los electrones. Pueden surgir algunas complicaciones durante los pasos de preparación necesarios para crear estas secciones delgadas, como la fijación química y la inclusión (generalmente en plástico). Estas preparaciones agresivas pueden desnaturalizar los antígenos, interrumpiendo su necesaria unión con los anticuerpos. Los investigadores han inventado y utilizado procesos específicos para sortear estos problemas y preservar la interacción entre el antígeno y los anticuerpos. Estos métodos incluyen la fijación por luz en lugar de la fijación química, la congelación de la muestra antes de seccionarla y su incubación a temperatura ambiente en lugar de a altas temperaturas. [ 1 ]
Los enlaces entre anticuerpos y sus respectivos antígenos, o entre anticuerpos y sus marcadores de oro, pueden ser solo parcialmente seguros debido a los efectos de las bajas concentraciones o al impedimento estérico en la unión. Los grupos de control son esenciales para tener en cuenta la cantidad de marcaje que ocurre naturalmente sin un virus. [ 5 ]
Resultados
Los resultados de la inmunomicroscopía electrónica se cuantifican visualmente. Para que el análisis cuantitativo sea efectivo, la muestra debe poseer ciertas características, lo que limita su frecuencia de uso. Es aplicable en situaciones como la determinación de la cantidad de partículas de oro coloidal unidas a un anticuerpo específico. [ 5 ] Durante experimentos exitosos, la inmunomicroscopía electrónica permite localizar proteínas con precisión y fortalecer la comprensión de la relación entre estructura y función. Estos procesos de marcaje y localización ayudan a los investigadores a comprender diversas vías y procesos celulares. [ 3 ]
Los protocolos de fijación e inclusión para microscopía electrónica afectan fuertemente los resultados de la formación de complejos inmunes: muchos procedimientos de fijación y procesamiento de microscopía electrónica, como la serie de deshidratación que conduce a la polimerización en plástico Epon, o la reticulación de proteínas con glutaraldehído-formaldehído, no permiten la unión de un anticuerpo a su diana anterior. En un artículo se demostró que el mantenimiento de sitios de unión activos, a través de un procedimiento suave de fijación e inclusión para microscopía electrónica, reveló que el transporte citoplasmático que antes se creía que ocurría a través de microvesículas era en realidad un artefacto de preparación, derivado de un anticuerpo marcado con peroxidasa utilizado antes de la fijación: el marcaje directo con inmunogold en secciones de microscopía electrónica Lowicryl mostró transporte citoplasmático sin vesículas en tejidos ováricos. [ 6 ] .
1987:216A:395-401. Adv Exp Med Biol \1987:216A:395-401. doi: 10.1007/978-1-4684-5344-7_45.
Historia
En 1931, Ernst Ruska (Premio Nobel de Literatura de 1986) y Max Knoll crearon el primer microscopio electrónico. Este invento dio lugar al microscopio electrónico de barrido y al microscopio electrónico de transmisión, que posteriormente contribuyeron a la inmunomicroscopía electrónica. Inicialmente, la tecnología solo permitía obtener imágenes bidimensionales, pero ahora, gracias a la tecnología moderna, también se pueden obtener imágenes tridimensionales. [ 3 ]
La inmunomicroscopía electrónica surgió en la década de 1940, cuando dos grupos independientes combinaron el virus del mosaico del tabaco y su antisuero. Posteriormente, lo examinaron bajo un microscopio electrónico. En aquel entonces, la resolución era mucho menor debido a la falta de contraste adicional y a la baja calidad de los microscopios de la época. Se sabía que las partículas utilizadas en el experimento tenían forma de varilla, y ambos grupos de investigadores observaron que estas varillas se agrupaban, alcanzando aproximadamente el doble de su tamaño original. Más de una década y media después, los investigadores comenzaron a utilizar anticuerpos individuales unidos a virus. Finalmente, en 1962, surgieron los anticuerpos teñidos negativamente. [ 4 ]
Aplicaciones
virus
La microscopía electrónica de transmisión proporciona información general sobre la estructura, pero tiene dificultades para diferenciar partes más detalladas de un virus o célula. La inmunomicroscopía electrónica ayuda a diagnosticar infecciones virales y a localizar antígenos virales en vacunas. [ 5 ] La inmunomicroscopía electrónica puede diagnosticar enfermedades e identificar patógenos . Un ejemplo es su capacidad para mostrar la destrucción de la mielina en la membrana basal . Este daño puede estar asociado con impulsos nerviosos más lentos, lo que resulta en una amplia gama de problemas cognitivos y físicos. Otro ejemplo incluye la identificación de lesiones cutáneas . En este caso, los científicos descubrieron fibrillas de anclaje insuficientes en la membrana basal, lo que provocó que la piel fuera más frágil. En ambos casos, los científicos identificaron un antígeno específico para utilizar la inmunomicroscopía electrónica y así descubrir y aprender más sobre estas enfermedades. [ 7 ]
Biopsias renales
Inicialmente, las biopsias renales se realizaban mediante microscopía de inmunofluorescencia, que ofrecía una resolución menor que la inmunomicroscopía electrónica. Antes de cambiar de la microscopía óptica a la electrónica, los resultados mostraron numerosas biopsias que requerían microscopía electrónica adicional para garantizar un diagnóstico más preciso. El uso adicional de la inmunomicroscopía electrónica se realizó tanto para establecer el diagnóstico inicial como para confirmar los hallazgos de la microscopía óptica. Los científicos decidieron realizar un estudio de investigación sobre la eficacia de cada tipo de microscopía. En muchos casos, utilizando solo microscopía óptica, los médicos no pudieron realizar un diagnóstico inicial. Algunos incluso recibieron diagnósticos incorrectos. El tipo de diagnóstico también desempeñó un papel crucial en el experimento. La microscopía óptica de fluorescencia identificó con precisión algunos diagnósticos sin necesidad de seguimiento. Otros fueron mucho más difíciles de diferenciar y requirieron microscopía electrónica. Incluso en los pacientes en los que la microscopía de inmunofluorescencia arrojó resultados correctos, los investigadores consideraron que aún se necesitaba confirmación. Los resultados de este estudio demostraron la necesidad de cambiar de la microscopía óptica a la electrónica para el diagnóstico de biopsias renales. [ 8 ]
Referencias
- 1 2 3 4 5 Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Kaiser, Chris; Krieger, Monty; Bretscher, Anthony; Ploegh, Hidde; Amon, Angelika; Martin, Kelsey (1 de abril de 2016). Biología celular molecular (8.ª ed.). WH Freeman. ISBN 978-1464183393.
- ↑ "Servicios de inmunomicroscopía electrónica en el Laboratorio Central de Microscopía Electrónica - Facultad de Medicina de UMASS" . Facultad de Medicina UMass Chan . 2 de noviembre de 2013. Consultado el 5 de diciembre de 2022 .
- 1 2 3 "Microscopía inmunoelectrónica" . El Atlas de Proteínas Humanas .
- 1 2 Milne, Robert G. (1991). Microscopía electrónica de patógenos vegetales . Springer, Berlín, Heidelberg. págs. 87–102 . doi : 10.1007/978-3-642-75818-8_7 . ISBN 978-3-642-75818-8. S2CID 80868758 . Consultado el 6 de diciembre de 2022 .
- ↑ Templeman, KH; Wira, CR (1987). "Localización ultraestructural de IgA e IgG en células epiteliales uterinas tras la administración de estradiol" . Avances recientes en inmunología de las mucosas . Avances en medicina experimental y biología. Vol. 216A. págs. 395–401 . doi : 10.1007/978-1-4684-5344-7_45 . ISBN 978-1-4684-5346-1. PMID 3687530 .
- ↑ Cardones, Adela Rambi G.; Hall, Russell P. (1 de enero de 2019). "63 - Enfermedades ampollosas de la piel y las mucosas" . Inmunología clínica (5.ª ed.). Elsevier. págs. 857–870.e1. ISBN 978-0-7020-6896-6Consultado el 6 de diciembre de 2022 .
- ↑ Haas, M. (1 de enero de 1997). "Una reevaluación de la microscopía electrónica de rutina en el examen de biopsias renales nativas" . Journal of the American Society of Nephrology . 8 (1): 70– 76. doi : 10.1681/ASN.V8170 . ISSN 1046-6673 . PMID 9013450. S2CID 26970189. Recuperado el 6 de diciembre de 2022 .
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